CIC-1氯离子通道亚型的克隆及相关电生理特性的研究
发布时间：2023-05-24 23:05
研究背景： 氯离子通道在细胞兴奋性调节，跨上皮物质转运，细胞容 积调节，细胞器酸化作用中发挥重要的作用，甚至在细胞免疫 应答，细胞迁移，细胞增殖和分化等过程中也有一定作用。这 种功能的多样性对应于不同种类的氯离子通道，而且这些通道 由多种完全不同的基因编码。电压门控氯离子通道（ClC）是其中 的一类，而且ClC基因分布广泛，存在于动物、植物、酵母和 细菌中。目前从哺乳动物细胞中已经克隆得到了九种不同的ClC 通道。ClC通道的功能缺失或改变与人类的某些遗传性疾病有 密切的关系，如先天性肌强直，肾结石，Bartter’s综合征。ClC-1 氯离子通道（ClC-1）是第一个从哺乳动物中克隆得到的ClC通 道，其主要表达于骨骼肌，但在心脏、肾脏和平滑肌中也有少 第四军医大学博士论文 量表达。目前的研究结果表明，CIC－1 与先天性肌强直疾病关 系密切。 CIC＊作为哺乳动物中第一个发现的趴 通道，近十年来 ...
【文章页数】：148 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
英文缩写词表
中文摘要
英文摘要
1 文献综述
1.1 ClC通道的生物学及相关疾病
1.1.1 ClC通道的分类
1.1.2 ClC通道的结构和典型特性
1.1.3 ClC通道的生理作用和相关疾病
1.1.4 结论
1.2 ClC通道基因转录中剪接的多样性及通道亚型
1.3 ClC-1的研究进展评价
1.4 C6细胞氯离子通道的研究现状分析
2 问题提出及本文的研究目标和内容
3 材料和方法
3.1 细胞的培养
3.2 离子通道cDNA的克隆方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 细胞总mRNA的提取
3.2.3 3'端的扩增
3.2.4 5'端的扩增
3.2.5 中间段的分段扩增
3.2.6 cDNA的电泳、提纯和测序
3.2.7 GenBank数据库检索与扩增片段的确认
3.2.8 cDNA质粒载体的构建和cDNA的亚克隆
3.2.9 内切酶的设计与cDNA片段的连接策略
3.2.10 质粒的扩增和提纯
3.3 通道基因的体外转录
3.4 非洲爪蟾卵母细胞的分离和培养
3.4.1 爪蟾的饲养
3.4.2 卵母细胞分离和培养用液体
3.4.3 手术方法
3.4.4 卵母细胞的分离
3.4.5 卵母细胞的挑选
3.4.6 卵母细胞的培养
3.5 mRNA的纳升注射与表达
3.6 双电极电压钳电生理实验
3.6.1 记录的条件和方法
3.6.2 记录用液体
3.7 数据分析的工具和方法
4 结果
4.1 大鼠ClC-1的五个通道亚型的cDNA序列及氨基酸序列
4.1.1 cDNA3'端的获取
4.1.2 cDNA近5'端片段的获取
4.1.3 cDNA中间片段的获取
4.1.4 片段的连接和大鼠ClC-1的5个通道亚型全长cDNA的获取
4.1.5 大鼠ClC-1的5个通道亚型的氨基酸序列特征
4.1.6 cDNA的体外转录得到mRNA
4.2 大鼠ClC-1五个通道亚型基因的表达和电生理特性
4.2.1 M5的通道电流与离子选择性
4.2.2 M5的稳态相对开放率对电压和氯离子浓度的依赖性
4.2.3 9-AC对M5的阻断
4.2.4 M5的通道电流对细胞外pH的依赖性
4.3 大鼠WT ClC-1的通道电流与离子选择性
4.4 大鼠WT ClC-1对电压和细胞外氯离子浓度的依赖性
4.5 细胞外Ⅰ-对大鼠WT ClC-1的阻断
4.6 9-AC对大鼠WT ClC-1的阻断
4.7 细胞外pH的变化对大鼠WT ClC-1的影响
4.7.1 细胞外pH的变化对通道电流的影响
4.7.2 细胞外pH的变化对通道相对开放率的影响
4.7.3 细胞外Ⅰ-在不同pH下的阻断作用
4.7.4 细胞外9-AC在不同pH下的阻断作用
4.8 通道亚型与大鼠WT ClC-1共同表达的通道的基本特性
4.9 WT ClC-1门控机理模型的建立与分析
4.10 通道电流长时间动态检测和记录软件的设计
5 讨论
5.1 ClC-1组织分布及作用的多样性
5.2 ClC-1基因转录中剪接多样性的机理
5.3 ClC-1结构与功能关系的进一步揭示
5.4 9-AC浓度依赖性阻断机制的分析
5.5 细胞外Ⅰ-的浓度依赖性阻断和离子选择性原理
5.6 ClC-1存在可滴定的电压感受器
5.7 ClC-1的非均衡性的门控机理
5.8 结论和展望
参考文献
已经发表的论文目录
致谢
本文编号：3822455
【文章页数】：148 页
【学位级别】：博士
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1 文献综述
1.1 ClC通道的生物学及相关疾病
1.1.1 ClC通道的分类
1.1.2 ClC通道的结构和典型特性
1.1.3 ClC通道的生理作用和相关疾病
1.1.4 结论
1.2 ClC通道基因转录中剪接的多样性及通道亚型
1.3 ClC-1的研究进展评价
1.4 C6细胞氯离子通道的研究现状分析
2 问题提出及本文的研究目标和内容
3 材料和方法
3.1 细胞的培养
3.2 离子通道cDNA的克隆方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 细胞总mRNA的提取
3.2.3 3'端的扩增
3.2.4 5'端的扩增
3.2.5 中间段的分段扩增
3.2.6 cDNA的电泳、提纯和测序
3.2.7 GenBank数据库检索与扩增片段的确认
3.2.8 cDNA质粒载体的构建和cDNA的亚克隆
3.2.9 内切酶的设计与cDNA片段的连接策略
3.2.10 质粒的扩增和提纯
3.3 通道基因的体外转录
3.4 非洲爪蟾卵母细胞的分离和培养
3.4.1 爪蟾的饲养
3.4.2 卵母细胞分离和培养用液体
3.4.3 手术方法
3.4.4 卵母细胞的分离
3.4.5 卵母细胞的挑选
3.4.6 卵母细胞的培养
3.5 mRNA的纳升注射与表达
3.6 双电极电压钳电生理实验
3.6.1 记录的条件和方法
3.6.2 记录用液体
3.7 数据分析的工具和方法
4 结果
4.1 大鼠ClC-1的五个通道亚型的cDNA序列及氨基酸序列
4.1.1 cDNA3'端的获取
4.1.2 cDNA近5'端片段的获取
4.1.3 cDNA中间片段的获取
4.1.4 片段的连接和大鼠ClC-1的5个通道亚型全长cDNA的获取
4.1.5 大鼠ClC-1的5个通道亚型的氨基酸序列特征
4.1.6 cDNA的体外转录得到mRNA
4.2 大鼠ClC-1五个通道亚型基因的表达和电生理特性
4.2.1 M5的通道电流与离子选择性
4.2.2 M5的稳态相对开放率对电压和氯离子浓度的依赖性
4.2.3 9-AC对M5的阻断
4.2.4 M5的通道电流对细胞外pH的依赖性
4.3 大鼠WT ClC-1的通道电流与离子选择性
4.4 大鼠WT ClC-1对电压和细胞外氯离子浓度的依赖性
4.5 细胞外Ⅰ-对大鼠WT ClC-1的阻断
4.6 9-AC对大鼠WT ClC-1的阻断
4.7 细胞外pH的变化对大鼠WT ClC-1的影响
4.7.1 细胞外pH的变化对通道电流的影响
4.7.2 细胞外pH的变化对通道相对开放率的影响
4.7.3 细胞外Ⅰ-在不同pH下的阻断作用
4.7.4 细胞外9-AC在不同pH下的阻断作用
4.8 通道亚型与大鼠WT ClC-1共同表达的通道的基本特性
4.9 WT ClC-1门控机理模型的建立与分析
4.10 通道电流长时间动态检测和记录软件的设计
5 讨论
5.1 ClC-1组织分布及作用的多样性
5.2 ClC-1基因转录中剪接多样性的机理
5.3 ClC-1结构与功能关系的进一步揭示
5.4 9-AC浓度依赖性阻断机制的分析
5.5 细胞外Ⅰ-的浓度依赖性阻断和离子选择性原理
5.6 ClC-1存在可滴定的电压感受器
5.7 ClC-1的非均衡性的门控机理
5.8 结论和展望
参考文献
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致谢
本文编号：3822455
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