胰岛素B9-23多肽体外负载免疫耐受型DC疫苗的制备及其相关机制的研究

发布时间：2021-03-26 09:55

背景和目的: 1型糖尿病被认为是由T淋巴细胞介导的选择性破坏胰岛β细胞的一种自身免疫性疾病。T1DM患者一旦出现明显的临床症状,约有80%的胰岛已经被破坏,因此强调T1DM的早期诊断和早期预防的意义显得尤为重要。一系列的自身抗原包括胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛素瘤相关蛋白2(IA-2)、锌转运体8(ZnT8)等被认为是启动自身免疫反应的靶抗原。同时,一些细胞因子、趋化因子及炎症介质也参与了该自身免疫过程。其中,可产生IFN-γ等细胞因子的Th1型细胞是致病性T细胞,而Th2型T细胞通过释放IL-4和IL-10介导糖尿病的免疫保护作用。在应用NOD鼠的研究中证实,胰岛素/前胰岛素尤其是胰岛素B9~23肽段是启动NOD鼠自身免疫性糖尿病的最主要的自身抗原[1]。借助于NOD鼠模型,应用胰岛素或胰岛素多肽进行了大量的抗原特异性免疫治疗的研究,如鼻内或皮下给予胰岛素B9-23多肽或改变的胰岛素B9-23多肽可以延缓自身免疫性糖尿病的发展[2-3].但这个过程一般都需要借助于免疫佐剂的作用来刺激并增强抗原的免疫原性,单独应用抗原本身可能不足以被抗原递呈细胞所递呈,诱导免疫耐受。本研究着眼于抗原与抗原递呈细胞之间的相互作用,应用胰岛素B9-23多肽体外负载DCs,探讨其在诱导自身免疫耐受中的作用及相关机制。树突状细胞(dendritic cells , DCs)是体内最重要的专职性抗原递呈细胞,在自身免疫性糖尿病的发病过程中具有重要的作用,同时,DCs在维持机体的中枢免疫耐受和外周免疫耐受中也发挥着极其重要的作用[4],因而对自身免疫性疾病的治疗也具有重要的意义。在稳定状态下,DCs表达低水平的共刺激分子,具有较强的摄取抗原的能力,但刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱,从而诱导机体的免疫耐受。DCs提供T淋巴细胞活化所必需的3个信号[5]。第一信号为DCs提呈的抗原肽-MHC分子复合物与T细胞受体(TCR)的结合;第二信号为DCs表面的协同刺激分子与T细胞表面相应受体的结合;第三信号为DCs分泌的细胞因子促使活化的抗原特异性T淋巴细胞分化为不同的效应性T细胞亚群。只有当这些信号同时具备时,初始T淋巴细胞才能被有效地激活成为效应性T细胞,发挥免疫效应功能,如果缺乏有效的第二信号,抗原特异性T淋巴细胞将发生调亡或被诱导成无能状态,形成免疫耐受。DCs表面表达的CD40、CD80、CD86是与T淋巴细胞表面相应受体CD40L以及CD28分子结合的最主要的协同刺激分子,本研究应用RNAi技术有效沉默共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达,使其处于发育的不成熟阶段,然后体外负载胰岛素B9-23多肽,制备出致耐受性DCs疫苗,观察其对同种异体小鼠脾脏T淋巴细胞的作用,进而探讨其在自身免疫性糖尿病的预防和治疗中的作用,为自身免疫性糖尿病的防治提供重要的实验依据。方法: ①siRNA合成设计并合成针对小鼠骨髓树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的特异性siRNA,绿色荧光蛋白(GFP)标记的阴性对照siRNA是由非靶向任何已知的细胞mRNA的20-25个乱序核苷酸组成。 ②细胞培养无菌取ICR小鼠的骨髓细胞,用含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培养,同时加入10ng/ml的GM-CSF以及10ng/ml的IL-4诱导树突状细胞的产生,第2天及第4天进行半量换液。第6天,收集细胞,按2×105/孔加入24孔板中,370C5%CO2培养24小时,将其分为siRNA转染组(A)、阴性对照组(B)、空白对照组(C)FAM标记的阴性对照组(D)。 ③转染用Lipofectamine2000包裹siRNA并转染树突状细胞,抑制共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达。 ④转染效率检测共聚焦显微镜观察转染后的形态以及初步判断转染效率。 ⑤流式细胞术检测转染效率以及各组骨髓树突状细胞的表面CD11c,CD80,CD86,CD40,MHC-Ⅱ的表达。 ⑥rt-PCR 检测基因水平上CD80、CD86、CD40的表达情况,观察CD80/86/40特异的siRNA引起的靶细胞内目的基因的沉默效果。 ⑦混合淋巴细胞反应无菌分离ICR小鼠的脾淋巴细胞,于10cm培养皿中培养3个小时,收集悬浮细胞作为T淋巴细胞,按1:5的比例将T淋巴细胞和25ug/ml的丝裂霉素C灭活的树突状细胞混合培养,同时加入20ug/ml的胰岛素B9-23多肽,370C 5%CO2培养72小时,在培养结束前的18小时,加入3H-Tdr,送同位素科检测CPM值。 ⑧细胞因子检测收集各组混合淋巴细胞培养上清,ELISA检测细胞因子IL-10和IFN-γ的水平。结果: ①共聚焦显微镜下观察约80%的细胞内具有绿色荧光。②流式细胞术检测转染效率为79.92%,各组BMDC的CD11c的表达均在60%以上,与B、C两组相比,A组CD80、CD86、CD40的表达降低,但是并没有显著差异。 ③rt-PCR的结果显示,A组的CD80、CD86、CD40的表达下调。 ④混合淋巴细胞反应:A组、B组、C组的CPM值分别为2424.67±169.36、7484.33±133.44、7735.33±539.87,A组树突状细胞刺激T淋巴细胞增殖的能力显著低于B组和C组,p0.01。 ⑤细胞因子的检测:A组、B组、C组树突状细胞刺激T淋巴细胞分泌的IL-10(pg/ml)的水平分别为522.72±6.92、483.40±4.70、483.91±6.82,分泌的IFN-γ(pg/ml)的水平分别为1654.95±39.79、1971.76±62.85、1936.87±61.96,A组与B、C两组相比,T淋巴细胞分泌较多的IL-10以及较少的IFN-γ,差异具有统计学意义(p0.01)。结论: 应用RNA干扰技术能够有效抑制小鼠骨髓来源的树突状细胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达,制备出耐受性树突状细胞。经胰岛素B9-23多肽负载后,具有较弱的刺激T淋巴细胞增殖的能力,并且诱导初始T淋巴细胞向Th2方向分化,分泌较多的IL-10,而IFN-γ的分泌显著减少。这些研究表明,胰岛素B9-23多肽体外负载耐受性树突状细胞通过诱导T细胞无能、使其向Th2方向分化而发挥致免疫耐受作用,对自身免疫性糖尿病的早期防治具有重要的意义。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R392

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全文主要缩略语

胰岛素89-23多肽体外负载免疫耐受型DC疫苗的制备及其相关机制的研究

中文摘要

英文摘要

胰岛素 B9-23 多肽体外负载免疫耐受型 DC 疫苗的制备及其相关机制的研究

前言

1 材料与方法

2 结果

3 分析与讨论

4 小结

参考文献