LBD21-31基因调控杨树茎干次生生长的功能分析
发布时间：2020-12-10 13:56
木材资源对于整个人类社会具有不可缺少的重要意义。木材作为燃烧能源以及在造纸和建筑方面具有不可缺少的重要地位,树木的大部分生物量是木材,木材也称次生木质部。次生生长过程中维管形成层向内分化产生次生木质部,向外分化产生次生韧皮部,后续经历细胞膨胀扩增,次生壁沉积,细胞程序性死亡等一系列复杂发育过程使树干增粗,因此植物次生生长的基因调控网络具有重要的科研价值。本研究通过分析前期的基因表达数据选定LBD基因家族中的LBD21-31（Potri.010G186000）基因为研究对象,以杂交杨树84K为实验材料,克隆得到杨树LBD21-31基因片段,并成功构建35S::LBD21-31过表达载体,使用农杆菌介导的叶盘侵染转化技术侵染得到LBD21-31过表达转基因植株,通过RT-qPCR检测了LBD21-31在不同转基因植株中的表达量,后续通过表型分析和植株茎段切片观察分析了LBD21-31对杨树愈伤发育、根系发育及次生木质部发育的影响,使用DAP-seq分析了与LBD21-31直接作用的靶基因,为LBD基因家族研究和杨树良种选育提供了重要的理论依据,现有主要研究结果如下:（1）LBD21-31基...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
杨树木材形成过程中次生细胞壁转录调控网络Fig.1-1Thetranscriptionalnetworkregulatingsecondarywallbiosynthesisduringwoodformationinpoplar
山东农业大学硕士学位论文11qPCRMasterMix：购自南京诺唯赞生物科技有限公司；RNA提取试剂盒、DNaseI酶、RNaseI酶：购自宝日医生物技术有限公司；DNA产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒：购自北京康为世纪生物科技有限公司；限制性内切酶KpnI，XbaI、T4连接酶：购自于赛默飞世尔科技公司（ThermoFisherScientific）。光照培养箱型号GXZ-500C，品牌：宁波江南；小型冷冻高速离心机型号5424R，品牌：Eppendor；PCR仪型号LabcyclerGradient96，品牌：SENSOQUEST；凝胶成像分析仪型号TANON1600R，品牌：上海天能。2.2实验方法2.2.1LBD21-31过表达载体的构建2.2.1.1LBD21-31基因序列和载体图谱通过毛果杨基因数据库（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）输入LBD21-31基因号Potri.010G186000查询得到毛果杨LBD21-31的CDS序列。选取的过表达载体为PzP211+35s+PolyA，载体大小9014bp，其中启动子为CaMV35S，菌体培养过程中抗性为大观霉素（Spe），在转基因植株中抗性为卡那霉素（Kana）。图2-1PzP211+35S载体图谱Fig.2-1PzP211+35Svector
山东农业大学硕士学位论文27IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导目的蛋白的表达,在离心管中加入2mlLB和2μLAMP抗生素，混合均匀后加入200μL转化成功的大肠杆菌（DE3）菌液，摇床恒温37℃条件下180rpm培养24h。准备无菌锥形瓶，在锥形瓶中加入250mlLB和250μLAMP抗生素，混合均匀后加入2ml菌液。摇床恒温37℃条件下180rpm培养至OD600值约为0.5，15℃条件下静置30min，加IPTG至0.5mM，15℃条件下诱导24h。将诱导24h之后的蛋白菌液分装在50ml离心管中，离心机4℃条件下12000g离心5min，离心过程中将锥形瓶置于冰上。离心结束后吸干净离心管内壁附着的的LB液体，把离心后的菌体连同离心管一同放入-80℃冰箱保存。（3）基因蛋白互作使用磁珠（BeaverBeadsGSH）对蛋白菌液进行纯化，详细步骤见说明书。使用第一步提取的DNA，根据其浓度取100ngDNA加水至40μL。再取定量蛋白磁珠加PBS溶液至40μL，与40μL的DNA溶液混匀后制成80μL反应液。在20℃恒温150rpm条件下晃动1h。结合完成后将离心管置于磁力架上，等待吸附完成后弃上清液，保留沉淀。将沉淀使用PBST缓冲液洗五遍后，更换新的离心管，使用27μLEB悬浮沉淀，水浴锅98℃水浴10min。水浴完成后置于冰上冷却5min，离心机3000g条件下离心5s，离心管放置磁力架上，吸附完成后吸出上清液，取约25μL作为模板用于PCR扩增。割胶回收DNA后，提交DAP-seq文库，使用illumina方法进行高通量测序，每个样品准备了三个重复。图2-2pCold-GST载体图谱Fig.2-2pCold-GSTvector
【参考文献】：
期刊论文
[1]拟南芥LBD15互作蛋白的筛选和鉴定[J]. 郭兆来,孙旭东,杨永平,徐慧妮. 华北农学报. 2019(05)
[2]植物NAC转录因子的生物学功能[J]. 张慧珍,白雪芹,曾幼玲. 植物生理学报. 2019(07)
[3]LBD基因家族研究进展[J]. 石玉,沈诗雅,张倩茹,孙振美,邬荣领,郭允倩. 中国细胞生物学学报. 2019(04)
[4]毛果杨LBD基因家族的全基因组分析[J]. 芦强,邵芬娟,邱德有. 基因组学与应用生物学. 2018(01)
[5]84K杨愈伤组织再生体系和直接分化再生体系遗传转化的比较性研究[J]. 王丽娜,王玉成,杨传平. 植物研究. 2017(04)
[6]植物MYB转录因子功能及调控机制研究进展[J]. 左然,徐美玲,柴国华,周功克. 生命科学. 2012(10)
[7]植物的次生生长及其分子调控[J]. 田敏,夏琼梅,李纪元. 遗传. 2007(11)
[8]84K杨再生和遗传转化体系的优化[J]. 李科友,樊军锋,赵忠,周永学,高建社. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2007(07)
[9]84K杨叶片再生系统的建立[J]. 王树耀,田宗城,黄白红,徐艳. 湖南文理学院学报(自然科学版). 2004(04)
硕士论文
[1]84K杨再生和遗传转化体系的研究[D]. 周熙莹.东北林业大学 2013
本文编号：2908808
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
杨树木材形成过程中次生细胞壁转录调控网络Fig.1-1Thetranscriptionalnetworkregulatingsecondarywallbiosynthesisduringwoodformationinpoplar
山东农业大学硕士学位论文11qPCRMasterMix：购自南京诺唯赞生物科技有限公司；RNA提取试剂盒、DNaseI酶、RNaseI酶：购自宝日医生物技术有限公司；DNA产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、高纯度质粒小提试剂盒：购自北京康为世纪生物科技有限公司；限制性内切酶KpnI，XbaI、T4连接酶：购自于赛默飞世尔科技公司（ThermoFisherScientific）。光照培养箱型号GXZ-500C，品牌：宁波江南；小型冷冻高速离心机型号5424R，品牌：Eppendor；PCR仪型号LabcyclerGradient96，品牌：SENSOQUEST；凝胶成像分析仪型号TANON1600R，品牌：上海天能。2.2实验方法2.2.1LBD21-31过表达载体的构建2.2.1.1LBD21-31基因序列和载体图谱通过毛果杨基因数据库（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）输入LBD21-31基因号Potri.010G186000查询得到毛果杨LBD21-31的CDS序列。选取的过表达载体为PzP211+35s+PolyA，载体大小9014bp，其中启动子为CaMV35S，菌体培养过程中抗性为大观霉素（Spe），在转基因植株中抗性为卡那霉素（Kana）。图2-1PzP211+35S载体图谱Fig.2-1PzP211+35Svector
山东农业大学硕士学位论文27IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导目的蛋白的表达,在离心管中加入2mlLB和2μLAMP抗生素，混合均匀后加入200μL转化成功的大肠杆菌（DE3）菌液，摇床恒温37℃条件下180rpm培养24h。准备无菌锥形瓶，在锥形瓶中加入250mlLB和250μLAMP抗生素，混合均匀后加入2ml菌液。摇床恒温37℃条件下180rpm培养至OD600值约为0.5，15℃条件下静置30min，加IPTG至0.5mM，15℃条件下诱导24h。将诱导24h之后的蛋白菌液分装在50ml离心管中，离心机4℃条件下12000g离心5min，离心过程中将锥形瓶置于冰上。离心结束后吸干净离心管内壁附着的的LB液体，把离心后的菌体连同离心管一同放入-80℃冰箱保存。（3）基因蛋白互作使用磁珠（BeaverBeadsGSH）对蛋白菌液进行纯化，详细步骤见说明书。使用第一步提取的DNA，根据其浓度取100ngDNA加水至40μL。再取定量蛋白磁珠加PBS溶液至40μL，与40μL的DNA溶液混匀后制成80μL反应液。在20℃恒温150rpm条件下晃动1h。结合完成后将离心管置于磁力架上，等待吸附完成后弃上清液，保留沉淀。将沉淀使用PBST缓冲液洗五遍后，更换新的离心管，使用27μLEB悬浮沉淀，水浴锅98℃水浴10min。水浴完成后置于冰上冷却5min，离心机3000g条件下离心5s，离心管放置磁力架上，吸附完成后吸出上清液，取约25μL作为模板用于PCR扩增。割胶回收DNA后，提交DAP-seq文库，使用illumina方法进行高通量测序，每个样品准备了三个重复。图2-2pCold-GST载体图谱Fig.2-2pCold-GSTvector
【参考文献】：
期刊论文
[1]拟南芥LBD15互作蛋白的筛选和鉴定[J]. 郭兆来,孙旭东,杨永平,徐慧妮. 华北农学报. 2019(05)
[2]植物NAC转录因子的生物学功能[J]. 张慧珍,白雪芹,曾幼玲. 植物生理学报. 2019(07)
[3]LBD基因家族研究进展[J]. 石玉,沈诗雅,张倩茹,孙振美,邬荣领,郭允倩. 中国细胞生物学学报. 2019(04)
[4]毛果杨LBD基因家族的全基因组分析[J]. 芦强,邵芬娟,邱德有. 基因组学与应用生物学. 2018(01)
[5]84K杨愈伤组织再生体系和直接分化再生体系遗传转化的比较性研究[J]. 王丽娜,王玉成,杨传平. 植物研究. 2017(04)
[6]植物MYB转录因子功能及调控机制研究进展[J]. 左然,徐美玲,柴国华,周功克. 生命科学. 2012(10)
[7]植物的次生生长及其分子调控[J]. 田敏,夏琼梅,李纪元. 遗传. 2007(11)
[8]84K杨再生和遗传转化体系的优化[J]. 李科友,樊军锋,赵忠,周永学,高建社. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2007(07)
[9]84K杨叶片再生系统的建立[J]. 王树耀,田宗城,黄白红,徐艳. 湖南文理学院学报(自然科学版). 2004(04)
硕士论文
[1]84K杨再生和遗传转化体系的研究[D]. 周熙莹.东北林业大学 2013
本文编号：2908808
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