Dmrt2a和igf2bp1在斑马鱼胚胎发育中的功能研究

发布时间：2020-11-21 18:42

　　 MicroRNAs(miRNAs)在肌肉发育中发挥重要功能,它们参与肌肉的增殖、再生和修复等过程,发挥着调控肌肉数量及质量的功能。Dmrt2b(doublesex and mab-3 related transcription factor 2b)已经被证实参与斑马鱼(Danio rerio)慢肌的发育,作为dmrt2b的同源基因,dmrt2a在斑马鱼肌肉发育中的功能尚不清楚。本研究发现,在斑马鱼中敲降dmrt2a会造成胚胎发育的严重缺陷,并且引起快肌标记基因myhz-2的下调和慢肌标记基因myhz-5的上调。生物信息学预测dmrt2a是mi R-203的一个候选靶基因,mi R-203有两个亚型,mi R-203a和mi R-203b,两者之间只有一个碱基不同,且它们的核心序列完全相同,本研究选用mi R-203a作为研究对象。荧光素酶报告实验证实,mi R-203能够靶向结合dmrt2a 3?UTR来抑制dmrt2a的表达。在斑马鱼胚胎中注射mi R-203a mimic后,dmrt2a的表达受到了抑制。与敲降dmrt2a相似,mi R-203a过表达之后,导致myhz-2的下调和myhz-5的上调。本研究表明mi R-203a能够直接调控dmrt2a的表达进而调控快肌和慢肌的分化,斑马鱼中过表达mi R-203a和敲降dmrt2a都会损害快肌的发育并且促进慢肌的发育。生物信息学预测igf2bp1(insulin-like growth factor-2 m RNA-binding protein 1)也是mi R-203的候选靶基因,本研究发现,在斑马鱼胚胎中过表达mi R-203a会造成igf2bp1的表达下调,这说明mi R-203可能潜在结合igf2bp1,igf2bp1是mi R-203的潜在靶基因。在斑马鱼胚胎中敲降igf2bp1不会对斑马鱼的表型及肌肉发育造成影响,表明在斑马鱼胚胎中igf2bp1与肌肉发育没有功能关联。进一步研究发现,敲降igf2bp1会导致肝脏体积变小,肝细胞标记基因fabp10a的表达量减少,同时内胚层标记基因gata6和foxa3的表达没有变化。利用基因芯片技术对注射Cont-MO和igf2bp1-MO后两组芯片中基因的表达谱进行了分析,igf2bp1-MO组芯片中fabp10a的表达量显著下调,而gata6和foxa3的表达在两组芯片中则无差异。igf2bp1突变体(igf2bp1-/-)斑马鱼与WT(wild type)斑马鱼在外部形态上无差异,但是在igf2bp1-/-斑马鱼胚胎中,肝脏的体积变小,fabp10a的表达下调,gata6和foxa3的表达没有变化。本研究表明,igf2bp1在斑马鱼早期肝脏发育过程中是肝脏生长所必需的。综上所述,在斑马鱼胚胎发育中dmrt2a和igf2bp1分别在肌肉发育和肝脏发育中起重要作用。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

过程图,生物合成,过程,肌肉发育

图 1-1 miRNA 生物合成过程（Liu et al 2007）Fig. 1-1 miRNA biogenesis1.3 miRNAs 在肌肉发育中的功能miRNAs 在肌肉发育和疾病中发挥重要功能，肌肉特异 miRNAs 又称之为myo-miRNAs，包括 miR-1、miR-206 以及 miR-133a/b 等（Sempere et al 2004,Baskerville and Bartel 2005, Chen and Lodish 2005），它们参与肌肉的增殖、再生、重塑和修复过程，发挥着调控肌肉质量以及促进和维持身体内稳态的功能（Mitchelsonand Qin 2015, Diniz and Wang 2016）。miR-206 特异存在于骨骼肌中，miR-1 和miR-133a/b 在心肌中也有表达（Townley-Tilson et al 2010）。miR-27a 能够结合肌肉抑制素，促进成肌细胞的增殖，可能也是 myo-miRNAs 的一员（Huang et al 2012）。一些 miRNAs 在肌肉中的功能见表 1-1（Table 1-1）。

肝脏发育,斑马鱼,特异表达基因,肝脏

Dmrt2a 和 igf2bp1 在斑马鱼胚胎发育中的功能研究胎由于细胞增殖的障碍以及肝细胞凋亡的显著增加而不能形成肝脏出芽（Sadler et a2007）。Gata5 突变体呈现出肝脏体积变小甚至肝脏整体缺失的表型。在斑马鱼中单独敲除 gata4 或 gata6 会导致肝脏、胰腺以及小肠等起源于内胚层的器官的发育缺陷但在斑马鱼中同时敲除 gata4 以及 gata6，其胚胎则出现完全无肝脏的表型，这表明在斑马鱼早期肝脏发育过程中，gata4和gata6都是必需的（Holtzinger and Evans 2005Zhao et al 2008）。综上所述，斑马鱼肝脏各时期及其特异表达基因如下图所示：图 1-2（Fig. 1-2）。

表型,斑马鱼,胚胎

向斑马鱼单细胞胚胎中显微注射 Cont-MO 和 dmrt2a-MO，每个胚胎的注射量约为 5ng。比较两个注射组可以发现，相较于 Cont-MO 注射组，dmrt2a-MO 注射组的胚胎在24hpf时出现了不正常的身体弯曲并伴随着躯干短小的表型，如图2-1A-b，c。为了验证这种表型是否特异出现在 dmrt2a-MO 注射组胚胎中，我们又进行了挽救实验。共注射 dmrt2a mRNA 和 dmrt2a-MO 后发现之前出现的不正常的身体弯曲和躯干短小的表型得到了明显的改善，并根据胚胎发育的畸形程度，划分为正常表型、轻度畸形和重度畸形，并对三组注射组的胚胎表型进行了统计，结果见图 2-1B。
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