大菱鲆炎症小体关键组件分子SmASC的抗细菌感染功能

发布时间：2020-11-18 00:35

　　先天性免疫是宿主抵御病原菌感染的第一道防线,是机体内至关重要的系统性响应元件之一,其不仅可以防止感染和维持生理平衡,还对激活适应性免疫应答至关重要。在先天性免疫激活的过程中,炎症小体通过激活细胞焦亡从而诱发炎症反应发生是近年来被解析的关键信号。在哺乳动物中,炎症小体主要由三个组件所组成:Nod样受体蛋白、接头蛋白凋亡相关斑点样颗粒(Apoptosis associated speck like protein containing CARD,ASC)和效应蛋白。接头蛋白ASC在炎症小体激活过程中作为该组件的关键的连接分子,主要包含两个结构域:PYD结构域和CARD结构域。当上游受体蛋白识别到外源/内源性刺激信号后,可通过PYD-PYD的同源相互作用来招募ASC,然后通过其CARD结构域将PYD形成的丝状结构压缩成斑点,并招募pro-caspase-1,诱导IL-1beta和IL-18等炎症因子的成熟和释放。然而,在硬骨鱼中,炎症小体激活介导细胞焦亡的分子机制还有待进一步研究,因此,本论文拟以海水养殖经济鱼种大菱鲆为研究对象,鉴定介导炎症小体激活的关键组件,并解析其抗细菌感染分子机制,寻找有效的关键分子靶标,为水产养殖鱼类的病害防控提供新思路。本论文以哺乳动物上已经鉴定的相关炎症小体激活分子为基础,通过RACE技术克隆得到大菱鲆炎症小体激活的相关调控基因,包括SmGSDME、caspase-3和SmASC。通过多序列比对和进化树分析发现,不同物种中GSMDE的N端相对保守,其中大菱鲆的SmGSMDE和大黄鱼的DFNA5亲缘最为接近,且在N端具有一段亲膜结构域。而caspase-3的序列在整个生物进化过程中相对保守,且与许氏平鲇caspase-3的亲缘关系最近,其没有跨膜结构域。同时,大菱鲆的ASC和哺乳动物的ASC结构高度保守,均具有典型的PYD和CARD结构域,并且,从进化角度,其和牙鲆的ASC的亲缘关系最近。鉴于ASC在炎症小体组件形成过程中发挥的重要桥接功能,本论文拟进一步探索SmASC的功能。首先,经过表达SmASC蛋白后,采用DSS交联分析发现,SmASC蛋白能够形成典型的寡聚化特征。其次,在HEK293T细胞中过表达SmASC蛋白后,采用免疫荧光分析发现,SmASC蛋白能够在细胞内形成斑点状结构,并且PYD和CARD结构域在ASC寡聚化过程中均发挥了关键作用。然后,进一步分析了大菱鲆不同脏器中SmASC的转录水平发现其主在肝和肌肉中具有相对高的表达。最后,我们通过细菌腹腔注射感染发现,鳗弧菌和杀鱼爱德华氏菌侵染大菱鲆均能够诱导SmASC在不同器官中出现显著上调表达,显示其在抗细菌感染过程中可能发挥了重要功能。为了进一步探索SnASC在抗细菌感染分子机制,本论文采用活体注射siRNA对大菱鲆SmASC进行敲降后,通过杀鱼爱德华氏菌腹腔注射感染发现,SmASC敲降鱼体中细菌的定植显著增加。其次,采用活体注射SmASC过表达质粒后,通过杀鱼爱德华氏菌腹腔注射感染发现,SmASC过表达鱼体中细菌的定植量显著减少。综合上述结果,本论文揭示了SmASC在大菱鲆抗细菌感染过程中发挥了重要的作用,为进一步鉴定大菱鲆的受体蛋白并解析其下游效应蛋白在抗感染先天免疫应答中发挥的分子机制奠定了基础。
【学位单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S943
【部分图文】：

炎症,信号,结构域,小体

华东理工大学硕士学位论文?第５页??同上面两种炎症小体不同的是ＮＬＲＣ４受体由三个结构域组成，包括Ｎ端的ＣＡＲＤ，??中间的ＮＢＤ以及Ｃ端的ＬＲＲ。因为有ＣＡＲＤ结构域，而没有ＰＹＤ结构域，ＮＬＰＣ４炎??症小体的组装不需要接头蛋白ＡＳＣ，但是在ＡＳＣ存在的情况能够增强炎症反应，同时??也有证据表明缺少ＡＳＣ后，ＮＬＲＣ４通过ＣＡＲＤ－ＣＡＲＤ相互作用招募ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１，足??够引发ｃａｓｐａｓｅ－１和ＧＳＤＭＤ引发的细胞焦亡，但是没有ＩＬ－ｌｂ／ＩＬ－１８的成熟丨３７１。另外，??ＬＲＲ在ＮＬＲＣ４激活过程中起抑制作用，因为ＮＬＲＣ４缺少丨，ＲＲ结构域后也能激活??ｃａｓｐａｓｅ－１。目前鉴定到ＮＬＲＣ４的激活剂有三种：细菌的鞭毛、三型分泌系统的通道蛋??白和基座蛋白［３８］。在ＮＬＲＣ４炎症小体激活过程中，ＮＡ１Ｐ蛋白发挥着重要的功能，细菌??的鞭毛蛋白、三型分泌系统的通道蛋白和基座蛋白不能被ＮＬＲＣ４所识别，需要在ＮＡＩＰ??蛋白的帮助Ｆ形成复合体，使ＮＬＲＣ４的构象发生改变，暴露出来的ＣＡＲＤ结构域与??ｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ－１相互作用，组装成ＮＬＲＣ４炎症小体使ｃａｓｐａｓｅ－丨成熟，引发下游的炎症反??应【３８，３９］。??

序列,琼脂糖凝胶电泳,大菱鲆,斑马鱼

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序列,进化树,大菱鲆

２５０?ｂｐ??１〇〇?ｂｐ??图２．３?ＤＦＮＡ５琼脂糖凝胶电泳图??Ｆｉｇ．?２．３?Ａｇａｒｏｓｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?．Ｓ，／ｗＤＦＮＡ５．??９９??Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ?ｏｉｉｖａｃｅｕｓ??７２?ｒ￣???Ａｎａｂａｓ?ｔｅｓｔｕｃｔｎｅｕｓ??６１厂?＾???Ｌａｔｅｓ?ｃａｌｃａｎｆｅｒ??５５???Ｍｏｎｏｐｔｅｒｕｓ?ａｌｂｕｓ??８３??—?ＬａｎｍｉｃｎｔＨｙｓ?ｃｒｏｃｅａ???ＡＳｃｏｐｈｔｈａ／ｍｕｓ?ｍａｘｉｍ?ｕｓ???ＭａｓｔａｃｅｍｂｅＪｕｓ?ａｒｗａｔｕｓ???Ｏｒｅｏｃｆｉｒｏｍｉｓ?ｒｕｌｏｔｉｃｕｓ???Ｔ〇Ｄ￣?Ｉ?Ｍｄｉｙｌｓｉｎｃｉａ?ｚｅｂｒａ??１００?１?Ｐｕｎｄａｍｔｌｉａ?ｎｙｅｒｅｒｅｉ??ｉ—ｉ??０?１０??图２．４以ＡＪ法构建的＊ＳｍＤＦＮＡ５进化树??Ｆｉｇ．?２．４?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?５７ＷＤＦＮＡ５?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ?ｂｙ?ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ?ｍｅｔｈｏｄ．??２．４．２大菱鲆ｃａｖ／＾ｙｅ－Ｊ基因的克隆??根据哺乳动物和斑马鱼基因的序列比对信息，在序列保守序部分设计引??物，以大菱鲆的ｃＤＮＡ为模板获得大菱鲆ｃａ■Ｓ７７ｍ？ｅ－Ｊ的保守序列，其大小为?５０４?ｂｐ（图??２．７）。然后，通过５’?ＲＡＣＥ和３’?ＲＡＣＥ获得该基因的未知片段，大小分别为３４７?ｂｐ和??６３３?ｂｐ?（图?２．７）。??然后，经过序列拼接得到大菱鲆基因全长，其中?
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