感染无乳链球菌尼罗罗非鱼脾脏的病理学研究

发布时间：2020-03-31 01:31

【摘要】：罗非鱼是我国重要的养殖鱼类,其养殖产量占世界总养殖量一半以上。无乳链球菌(Group B streptococcus,GBS)是危害罗非鱼养殖的重要细菌性病原。罗非鱼无乳链球菌病是我国亟需控制和净化的水生动物三类疾病。目前,罗非鱼无乳链球菌病的研究已得到了足够的重视与支持,但研究热点集中在应用研究,基础研究相对薄弱。脾脏是鱼类重要的免疫造血器官,也是GBS主要侵袭的部位。因此,本论文对无乳链球菌感染后罗非鱼脾脏开展了系统的病理学研究,以期丰富该病的基础研究,为后续的应用研究提供奠定基础。为明确罗非鱼脾脏的正常结构和功能,本研究首先对正常的脾脏进行了组织学观察和血脾屏障定位;接着,对GBS感染后的脾脏进行了动态病理学观察,建立了病理评分体系,并对感染进行了分期,为后续深入研究脾脏的病理学提供了取样指导;通过超微病理学观察,对各病理分期的脾脏与细菌的互作关系进行了分析,揭示了脾脏的病理损伤机制和GBS的致病机制;在此基础上,对4种不同病理分期的脾脏进行了转录组测序,对脾脏的各病理分期的信号通路、关键基因进行了分析,为研究感染后脾脏的分子病理学提供了理论依据;并进一步,对各病理分期脾脏的免疫功能进行了探讨,为揭示脾脏免疫功能失败的分子机制提供了新思路。具体实验内容如下:1.尼罗罗非鱼脾脏的正常结构研究通过大体解剖、腐蚀,结合光学和电子显微技术对尼罗罗非鱼脾脏进行了观察。结果显示:尼罗罗非鱼脾脏为独立的脏器,位于前肠和胃之间。被膜薄、小梁不发达,红髓和白髓分界不清。白髓内椭球体清晰、具有少量黑色素巨噬细胞中心和淋巴细胞小泡。椭球体由立方状内皮细胞、网状纤维和吞噬细胞组成。脾索由网状细胞交织成网,红细胞变形通过网眼;网状细胞外周有淋巴细胞和单核-巨噬细胞附着。网状纤维主要分布在红髓的脾索和血管周围,而胶原纤维主要分布在脾索和脾动脉周围。结合腐蚀后脾脏的血管分布和脾脏的显微结构,可将脾脏分为3区:内区、中区和外区。台盼蓝活体染色法定位罗非鱼血脾屏障,结果显示:腹腔注射后,台盼蓝主要聚集在椭球体内皮细胞内;尾静脉注射后,台盼蓝主要附着于椭球体的网状纤维上。结果表明:罗非鱼血脾屏障位于椭球体,由椭球体内皮细胞和网状纤维组成。2.无乳链球菌感染后尼罗罗非鱼脾脏的动态病理研究使用剂量为1×107cfuGBS攻毒罗非鱼,于注射后0-72h,每4h采集脾脏,记录脾脏的大体、组织病理变化和细菌的动态分布。结果显示:大体病理变化主要体现在脾体指数和被膜。表现为:脾体指数在攻毒后4-8 h显著降低,12-20 h显著增加,24-36 h恢复正常,并在40-72 h极显著增加;被膜在40-72 h可见白色纤维素膜覆盖。主要组织病理变化为:攻毒后4-8h,椭球体聚集、脾血窦空虚、淋巴细胞和MMCs增多;12-20 h,椭球体内皮细胞空泡变性、幼红细胞增多、淋巴细胞和MMCs减少;24-32h,椭球体周围网状细胞增生,MMCs和淋巴细胞大量减少;36-40h,脾脏内形成增生性结节;44-72 h,增生性结节发展为渗出性或坏死性结节。被膜和被膜下组织在44-72 h出现带状坏死,与正常组织交界处形成明显的反应带。血管和纤维在攻毒后4-8 h,血管内壁受损,网状纤维收缩、聚集;12-44 h,网状纤维逐渐断裂、溶解;48-72 h,网状纤维几乎消失,胶原纤维逐渐溶解。细菌在攻毒后20 h在椭球体内皮细胞中出现,24-48 h数量增多,但始终位于椭球体内皮细胞内;52-72 h后,大多数脾脏的细菌数量明显减少。结合典型病理变化和GBS含量,可将脾脏分为4期,各期的特征性病理变化为:早期,椭球体聚集;反应期,幼红细胞增多;缓滞期,增生性结节;危亡期,坏死性结节形成。3.无乳链球菌剂量对尼罗罗非鱼脾脏感染分期的影响使用不同剂量GBS(A-1×106cfu、B-1×107cfu、C-1×108cfu)攻毒罗非鱼,分别于注射后4 h,8 h,24 h,72 h,以及A组的7 d和14 d采集脾脏,记录脾脏的大体、组织病理变化和细菌的含量,并运用评分体系进行感染分期。结果显示:A、B、C组鱼体出现死亡时间分别为10 d、40 h和16 h。病理分期为:A组4-8 h为早期,24-72 h为反应期和缓滞期,7 d为危亡期;C组4-8 h为早期和反应期,24-72 h为缓滞期和危亡期,同时在8-24 h新增了急性坏死期。B组病理分期同第三章。构建sip-qPCR方法,对各感染时间点的GBS进行定量分析,结果显示:A组0-7 d均无GBS检出;B组,8 h开始检测到少量GBS,24 h GBS数量最多,72 h GBS减少;C组与B组GBS数量变化趋势一致,但C组GBS含量高于B组。结果表明:攻毒浓度可影响脾脏的病理分期和脾脏的细菌含载量;在1.0×108cfu攻毒剂量时,出现了第5种病理分期,即急性坏死期。4.无乳链球菌感染尼罗罗非鱼脾脏的超微病理学观察透射电镜技术观察5种病理分期中脾脏与GBS的互作关系,结果显示:早期,脾脏椭球体毛细血管收缩,单核细胞贴壁并穿透血管壁进入脾脏实质;脾细胞损伤不明显;细菌数量少。反应期,吞噬细胞内初级/次级溶酶体增加,胞浆内可见大量单层、双层甚至多层膜包裹的细菌和细菌残屑;部分吞噬细胞和淋巴细胞的线粒体肿胀和核膜扩张;少数GBS在胞内存活并繁殖。缓滞期,细胞内细菌数量明显减少,椭球体周围网状细胞大量增生。危亡期椭球体毛细血管内皮细胞坏死,脱落堵塞血管腔;细菌数量少。急性坏死期,椭球体内皮细胞内满载细菌;红细胞参与吞噬杀灭细菌。整个感染过程中,存活细菌表面具有丰富的荚膜围绕,而死亡细菌表面未观察到荚膜。扫描电镜观察急性坏死期脾细胞的形貌变化,结果显示:GBS感染后脾脏内红细胞鼓胀变形,并在脾髓内大量淤滞;GBS附着在网状纤维上。结果表明:脾脏的椭球体内皮细胞、红细胞和吞噬细胞可吞噬和清除GBS;而GBS可损伤细胞,并产生荚膜促进胞内存活。5.无乳链球菌感染尼罗罗非鱼脾脏的转录组分析Illumina HiSeqTM 2500高通量测序技术检测脾脏反应期(Lym)、急性坏死期(Nec)、缓滞期(Hem)、危亡期(Hyp)的mRNA变化,结果显示:GBS感染后,共获得感染差异基因6295个,其中共有差异基因364个,特有差异基因Lym 834个,Nec 1578个,Hem 232 个,Hyp 568 个。对感染差异基因、共有差异基因和特有差异基因进行GO富集性分析,结果显示:感染差异基因和共有差异基因分别在免疫反应和抗原识别与递呈反应中显著富集;Lym、Nec、Hem特有差异基因分别显著富集于免疫和抗炎反应、分解代谢过程、细胞分裂增殖反应中;Hyp特有差异基因在分子功能和生物学过程中富集均不显著。对感染差异基因、共有差异基因和各分期的特有差异基因进行KEGG信号通路富集性分析,结果显示:感染差异基因和共有差异基因分别显著富集于免疫系统通路和信号传导通路中;Lym、Nec、Hem特有差异表达基因分别主要富集于细胞因子-细胞因子信号通路和TNF信号通路、脂肪酸降解信号通路、细胞周期通路中;Hyp特有差异基因中无显著富集信号通路。筛选共有差异基因和特有差异基因中,FPKM100的参与免疫、炎症和造血的基因,结果显示:共有差异基因中组织蛋白酶L差异显著;Lym中CXCL10和IV型胶原蛋白酶差异显著;Nec中IL-8和补体C1q子亚基B差异显著;Hem中MHCI和DDIT4差异显著;Hyp中MHCⅡγ、组织蛋白酶D、CD209、血红蛋白α和甘露糖凝集素差异显著。结果表明:Lym差异基因主要富集于免疫反应,可能与淋巴细胞增多有关;Hem中细胞周期通路显著变化,可能与网状细胞增生有关;Nec中脂肪酸降解信号通路基因显著,可能与细胞的坏死有关。6.无乳链球菌对尼罗罗非鱼脾脏免疫功能的影响RNA-Seq分析尼罗罗非鱼脾脏的PRRS(TLRs、NLRs、RLR、CLRs),结果显示:GBS后,TLRs表达量明显高于较其他PRRS,其中TLR5在Nec、Lym和Hem中显著上调,TLR13在Nec、Lym中显著下调,而TLR1在Nec、Lym和Hyp中显著下调。将TLRs序列与NCBI和UniPort中报道的其他鱼类和人类TLRs进行比对,并采用Mega 4.1软件中的邻接法构建系统进化树。结果显示:罗非鱼的TLR5与人、斑马鱼等的TLR5聚为一簇。对TLR5介导的下游因子IL-1β和IL-8的检测显示:IL-1β、IL-8在Nec中显著高于其他各组。推测TLR5介导促炎因子IL-1β和IL-8的大量表达,可能是导致脾脏过度炎症,出现脾脏急性坏死的重要因素。分析免疫系统相关因子 C3、MHCⅡα、CSF1R、TCRα、TCRβ,MHCI、RAG1、IgM并对变化显著的基因进行qPT-PCR验证。结果显示:C3、TCRα、TCRβ、CSF1R、RAG1、MHCI在罗非鱼感染前后表达量变化不显著;MHC Ⅱ在Hyp、Hem中显著下调;而IgM在GBS感染后显著上调。提示,脾脏的体液免疫是GBS感染后的主要免疫应答系统,而IgM是重要的免疫分子。进一步对罗非鱼sIgM进行原核克隆表达,制备兔抗IgM-IgG抗体,运用ELISA和免疫荧光分别检测感染后血清IgM效价和脾脏中IgM分布。结果显示:原核sIgM蛋白在BL21-PET32-sIgM中成功得到了表达。运用sIgM免疫家兔获得了亲和力高、特异性强的sIgM-IgG。ELISA检测血清IgM显示感染后IgM均未升高,且免疫荧光检测的脾脏中IgM的免疫荧光信号也未见明显变化。表明,GBS抑制了 IgM的转录后翻译。综上结果表明,GBS感染尼罗罗非鱼后,脾脏的结构和功能受到了明显的损伤。其中,增生可能是导致鱼体慢性死亡的重要原因;而过度的炎症反应可能是导致鱼体急性死亡的重要原因。
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（３）邋ＲＩＧ－Ｉ邋样受体（ＲＩＧ－Ｉ邋ｌｉｋｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，，ＲＬＲｓ）逡逑ＲＬＲｓ是具有抗病毒功能，能够识别细胞质中病毒的ＲＮＡ，诱导干扰素产生的一类逡逑模式识别受体，包含３个成员（图１－２）：视黄酸诱导基因Ｉ邋（Ｒｅｔｉｎｏｉｃ邋ａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ邋ｇｅｎｅ邋１，逡逑ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８）、黑色素瘤分化相关基因邋５邋（Ｍｅｌａｎｏｍａ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｇｅｎｅ邋５，逡逑ＭＤＡ５／ＩＦＩＨ１）和邋ＬＧＰ２（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅｔｉｃｓ邋ａｎｄ邋ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ邋２／ＤＨＸ５８）。其中邋ＲＩＧ－Ｉ邋和逡逑ＭＤＡ５通过不同的分子机制，识别不同的病毒，并通过线粒体抗病毒信号通路（ＭＡＶＳ，逡逑８逡逑

￣ＮＡＣＨＴ邋｜逦逡逑图１－１邋ＮＯＤ样受体的分类与结构［８９］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＮＯＤ－ｌｉｋｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ＾８９＇逡逑相比哺乳动物的ＮＬＲｓ，鱼类具有更加广泛的ＮＬＲｓ家族。在硬骨鱼类中还发现了逡逑一类鱼类特有的含ＰＹＤ结构域的ＮＬＲ亚家族成员。该蛋白在ＮＬＲＰ的Ｃ端多出一个逡逑Ｂ３０．２区，即ＰＲＤ－ＮＡＣＨＴ－ＬＲＲ－Ｂ３０．２。分析该蛋白结构显示，Ｂ３０．２替代了邋ＬＲＲ的作逡逑用，成为病原识别位点［９４］。目前，在鱼类中己发现有８种保守的ＮＬＲｓ蛋白，包括转录逡逑调节子ＣＩＩＴＡ和ＮＬＲ５，炎性小体和Ｎｏｄ小体蛋白ＮＯＤＩ，邋Ｎ０Ｄ２，ＮＯＤ３／ＮｌｒＣ３，逡逑Ｎ０Ｄ９／ＮＬＲＸ１，以及目前功能尚不清楚的ＮａｃｈｔＰｌ／ＮＷＤｌ和ＡＰＡＦ１１９５１。自２００８年，在逡逑斑马鱼上首次发现哺乳动物ＮＬＲｓ同源物以来，己在斑马鱼上发现约４００种ＮＬＲｓ蛋白逡逑［９６］。在鲶鱼中已发现了邋５邋种邋ＮＬＲ：邋ＮＯＤＩ，邋ＮＯＤ２，邋ＮＬＲＣ３，邋ＮＬＲＣ５邋和邋ＮＬＲＸ１【９７］。草逡逑鱼中发现了邋ＮＯＤ１和ＮＯＤ２［９８］；虹鳟具有２个ＮＯＤ２的剪接变异体［９９］；牙庝具有鱼类逡逑特有的ＮＬＲＣｎ（Ｘ）］。南亚野鲮中发现了邋ＮＯＤ１类似物［１Ｑ１］；黑石斑鱼上发现了邋ＮＬＲＣ５。逡逑（３）邋ＲＩＧ－Ｉ邋样受体（ＲＩＧ－Ｉ邋ｌｉｋｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S943


本文编号：2608359