建立鲫鱼（Carassius auratus）微卫星标记Multiplex PCR系统分析群体与家系的遗传结构

发布时间：2020-03-31 00:26

【摘要】：鲫鱼(Carassius auratus)是我国重要的淡水养殖种类。其品种资源丰富,遗传方式复杂。生产上主要采用异种精子刺激雌核发育来生产和选育苗种形成了经济性状良好的品系,如中科3号等。但累代雌核发育后代的变异率低,对环境变化的适应性降低,或将导致种质资源衰退。此外异种精子刺激雌核发育的低变异率,可能导致优良品种的存续期受限。为了尝试提高亲本群体的多样性,以提高培育优良性状的潜力,本研究首先建立了高通量的鲫鱼鲫鱼微卫星标记Multiplex PCR体系,以此探查了不同来源的商业品系和自然群体的遗传多样性,并从中选择亲本,以同种三倍体鲫鱼精卵受精的方式产生家系;利用微卫星标记的共显性特征,以经济高效的Multiplex PCR体系探查不同来源和遗传背景的雌雄亲本遗传物质在子代中的传递规律及其对子代性状的影响,为鲫鱼优良品种的培育探索新途径。本研究通过系统检测已有的微卫星标记,并且根据产物区间的需要,重新设计了部分引物。通过多重PCR扩增测试,分别建立了 2套6个位点,1套13个位点及1套15个位点的荧光标记多重PCR反应体系。对来自江苏、河南、湖北和江西的7个鲫鱼良种场的15个商业品系(A、D、E标称为中科3号,B、F、G、H、I、J、K、L、M标称为异育银鲫,N、P、R标称为彭泽鲫)和1个黑龙江方正银鲫野生群体(C)进行遗传结构和亲缘关系分析。结果显示方正银鲫C (平均等位基因和基因型数目及观测杂合度分别是7.0, 5.4,0.68),洪泽异育银鲫F( 6.5, 5.1,0.80)和大丰异育银鲫G (5.3, 3.6,0.90)的遗传多样性较高,其它群体遗传多样性均较低(平均3.9, 2.3, 0.31)。聚类分析表明:野生群体C与商业品系均保持较大遗传距离,处于外群;标称为彭泽鲫的群体N、P、R间遗传距离较近,并与M间聚为一支;而标称为中科3号的A和E、D并没有聚为一支,而是分别与标称为异育银鲫的群体B;和群体H以及K、L、I等群体呈现出较近的亲缘关系。这说明,同样采用异种精子刺激雌核发育形成的中科3号系群可能在民间也被称为“异育银鲫”或其个体被用于亲本生产雌核发育子代。导致地方苗种场“中科3号”与“异育银鲫”界限不清。用Multiplex PCR体系扫描13个鲫鱼同种精卵受精产生的有性繁殖家系(n=20/家系)的亲本与个体,检测亲本在13个位点上的等位基因基因型在子代中的传递和分离模式。结果表明,13个家系在13个检测位点上均表现出不同程度的雄性DNA的插入,平均插入率达22.2%,显著高于异种精子刺激雌核发育形成的家系。亲本的基因型在子代中并不呈现孟德尔分离比,而是表现为雌核发育(完全与母本基因型相同,占比77.8%)与雄性遗传物质插入(表现为三种结果:一是仅有部分母本等位基因,占比16.5%;二是含有母本与父本等位基因,占比2.9%;三是含有亲本基因型之外的等位基因,占比2.8%)并存的现象。雄性DNA插入的比例在不同位点上介于0.59 (HLJY16)-0.01 (YJ30),在不同家系中介于 0.361 -0.09,均差异显著(p0.05),但雌核发育的比例,13个微卫星位点在各家系的比均无显著性差异(p0.05)。此外,家系的三龄子代中通过性腺观察检出相当比例的雄性个体,对其中2个家系的亲本和子代(n=5♀+5♂/家系)进行同样的基因型检测,发现与雌性子代相比,雄性子代的基因型中雄性亲本DNA插入率较低。这是受检测样品数较少的影响还是其他原因,尚待进一步研究。
【图文】：

P群,退火温度,微卫星引物,鲫鱼

注：Ｍａｒｋｅｒ邋ＤＬ２０００邋的条带邋ｂｐ邋是（自上而下）：２０００，邋１０００，７５０邋（最亮），５００，２５０，邋１００逡逑Ｆｉｇ．２－１邋ＤＮＡ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋２０邋ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ邋ｉｎ邋Ｐ邋ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ邋ｗｉｔｈ邋１％邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉ２．３．２微卫星引物筛选结果逡逑通过对来自全国各鲫鱼良种场和野生水库的１６个鲫鱼群体在所有引物进行扩筛选、扩增兼容和实际产物大小检测，不同退火温度进行ＰＣＲ扩增尝试，最终选了产物大小分别分布在９０－２００ｂｐ，邋２００－３００ｂｐ，３００－４００ｂｐ，４００－５００ｂｐ四个区间的１８具有特异性强扩增的微卫星引物并标记上荧光，具体信息见表２－２．逡逑由Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｎ四个群体ＤＮＡ池在退火温度分别为５０°Ｃ和５５°Ｃ筛选微卫星物的电泳检测见图２－２，可以看到，提高退火温度，提高了引物特异性，例如：ＣＣＡ１在５０°Ｃ的多态性比５５°Ｃ高，提高退火温度的同时也提高了引物的特异性。逡逑

电泳图,微卫星位点,组合筛选,电泳图

逦海南大学硕士学位论文逦逡逑多个微卫星位点前后端引物组合在一起，进行不同退火温度和循环次数的扩增逡逑尝试，，筛选出符合构成Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ邋ＰＣＲ体系的微卫星位点，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ邋ＰＣＲ微卫星位点逡逑组合进行筛选的电泳图见图２－３。逡逑
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

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