Semaphorin 3B基因在神经胶质瘤的表达及临床意义
【摘要】 在中枢神经系统中，神经胶质瘤是最常见的肿瘤，来源于神经上皮细胞，发病率占全部原发脑肿瘤的40%以上，目前，由于对其发病机制尚不明了，依现有的治疗手段很难以治愈，所以主要以手术切除为目前的治疗手段，辅以放、化疗。但由于肿瘤与正常脑组织无明显界限，很难达到彻底根治，致使术后复发率极高，且生存期较短，由此可见，是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一，也是神经外科高死亡率疾病之一，也是困扰临床大夫的主要问题和尚待解决的难题。近年来的探索和研究神经胶质瘤发生发展中的改变，将有利于更好的理解神经胶质瘤的发病机制和发现肿瘤标志物提供研究基础，为开展胶质瘤个体化治疗提供理论依据。SEMA3B是近年发现的候选肿瘤抑制基因，位于3号染色体短臂21．3区域，属于Semaphorins蛋白家族，均属分泌型蛋白，Semaphorins家族蛋白具有多种生物活性，参与神经细胞再生、肿瘤形成、心脏血管的形态形成、免疫应答、神经细胞凋亡、血管内皮细胞迁移等诸多生理功能。我们通过对69例原发神经胶质瘤肿瘤组织包埋蜡块和10例正常脑组织包埋蜡块进行了免疫组织化学和相关临床特点分析， VEGF、NRP1、NRP2在正常脑组织中均表达为1例弱阳性。69例原发神经胶质瘤中VEGF、 NRP1、 NRP2阳性表达率分别为74.00%(51/69)、77.00%(53/69)、72.00%(50/69)，明显高于正常脑组织组，差异有统计学意义。低恶性度组(Ⅰ-Ⅱ级)和高恶性度组(Ⅲ-Ⅳ级)中VEGF、NRP1、NRP2的阳性表达率分别为：69.00%(20/29)、76.00%(22/29)、72.00%(21/29)；80.00%(32/40)、83.00%(33/40)、78.00%(31/40)；提示随肿瘤分级增加而增强（与胶质瘤恶性程度呈正相关），两组间差异有统计学意义。通过分析43例神经胶质瘤组织和3例正常脑组织的DNA甲基化，SEMA3B基因发生甲基化频率为21/43（48.8%），而正常脑组织均未发生甲基化。SEMA3B基因参与了DNA的修复和细胞凋亡，启动子的部分甲基化可能导致了其表达的下调原因之一，为神经胶质瘤的发生发展提供了选择性优势，可能影响肿瘤细胞的凋亡和迁移。为了明确SEMA3B基因的甲基化位点，选取43例神经胶质瘤组织和3例正常脑组织进行焦磷酸测序，与正常的脑组织相比，神经胶质瘤组织中SEMA3B基因的启动子区存在高密度的甲基化位点，SEMA3B基因启动子区的甲基化可能有肿瘤特异性，可能是神经胶质瘤组织与正常脑组织区别的重要分子标志物。SEMA3B基因在神经胶质瘤中的表达水平与恶性程度呈正相关。为了进一步了解神经胶质瘤的特性，以体外培养人胶质瘤细胞U251，并添加药物布鲁生（Brucine），利用qRT-PCT技术、MTT凋亡检测方法和流式细胞仪，观察Brucine对神经胶质瘤细胞凋亡的影响。结果显示，Brucine下调COX-2、BCL-2mRNA的表达，上调BAX mRNA的表达；而且，Brucine抑制神经胶质瘤细胞的凋亡。故此，推测SEMA3B可能与神经胶质瘤细胞的凋亡相关。可以为神经胶质瘤细胞研究及其临床介入治疗提供实验支持。综上所述，恶性肿瘤的发生、发展是一个多基因、多阶段、多因素作用的产物，为寻找神经胶质瘤的诊断治疗和预后提供理论基础，SEMA3B基因可能是神经胶质瘤治疗的一个新的靶点。
第 1 章 绪 论
在中枢神经系统中，神经胶质瘤是最常见的肿瘤，来源于神经上皮细胞，发病率占全部原发脑肿瘤的 40%以上[1-4]，原发性脑肿瘤患病率呈逐年递增趋势，据不完全统计，年增长率为1.2%，尤以中老年人群较为显著。我国原发性神经胶质瘤年发病率为3-6/10万人，每年死亡人数达到 3 万人以上，所以是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一，也是神经外科高死亡率疾病之一，也是一直困扰临床大夫的主要问题和尚待解决的难题。目前。由于对其发病机制尚不明了，依现有的治疗手段很难以达到治愈，所以主要以手术切除为目前的治疗手段，紧随其后化疗和放疗［5-6］。但最常见的原发性脑肿瘤，仍然还不能达到最佳治疗标准。短期内复发，一直都是临床上非常厄待解决的难题。相对目前为什么会导致胶质细胞的恶变、胶质瘤细胞的进展如何和短期复发的因素尚未明了，现在环境因素、化学因素、电离辐射和遗传因素等可能都会导致胶质瘤发病。有研究表明，神经胶质瘤的局部侵袭和转移与细胞增殖、分化异常和细胞凋亡等多种机制有关［7-9］。寻找神经胶质瘤的发生发展过程中，抑癌基因及其表达的改变和神经胶质瘤的发病关系，如 p53,RB,PTEN,p16,Mxil,CDKN2A,NF1 等都已被证实，有效的明确生物分子间和遗传信息，不仅可以进行对神经胶质瘤的精确定位，还可以提供相应的肿瘤标志物，为疾病的临床诊断和预后提供评估。
肿瘤的发生发展是一个多基因、多阶段、多因素参与的过程。恶性肿瘤是一种基因组的疾病，主要特征是原癌基因（生长因子及其受体、信号转导因子和基因转录调节因子等）的激活和抑癌基因的失活。失活是抑癌基因启动子区域的甲基化的重要分子机制［10］。如神经胶质瘤细胞过度生长，加速了肿瘤细胞的转移和扩散，从而使基因发生突变，过度表达或异常表达，引起肿瘤细胞的凋亡信号的失活，反之，诱导过度增生的细胞凋亡、上皮细胞的修复等，导致抑制肿瘤的发生。
.......................................
1.1 Semaphorins 3 家族研究进展
Sema 3s家族被首次发现具有轴突导向分子,而在脊椎动物是唯一分泌Semaphorin家族的成员。已知的生理和病理功能已经扩展到包括轴突的吸引力和排斥细胞凋亡、细胞迁移、生长锥崩溃、免疫反应、器官形成、肿瘤抑制和促进、脉管系统的发展[35-39]。我们理解这些Sema 3s的功能是对我们理解受体至关重要的。然而,我们的知识对Sema3s体系的构成还远未完成,我们缺乏详细、全面的审查[40]。作为Sema 3s受体,从生物、生化和体内分析推导,特别强调神经细胞。我们希望有助于揭示最需要进一步研究的领域。
1.1.1 Semaphorins(Sema3s)家族结果的一般受体
Sema 3s的受体是杂合物的二级受体,显著不同重叠Sema 3s的整体受体[41]。两个Nrp1和Nrp2被发现是Sema 3s信号转导的必需品,但是Sema 3s的特异性信号不能单独归因于Neuropilin。事实上,即使之前发现Neuropilins 是Sema 3s所必需的信号,从他的结构推断老鼠的神经系统Nrp1 表达发展中Nrp1可能是被异染的。同时,从胞质域Nrp1 发现Sema3s不需要信号,表明Neuropilins一致行动与其他受体作为应变转换细胞外信号的细胞内信号通路。
Plexins(PlexinAs)类是第一个确定作为Sema 3s主要的共同受体,这些初步的研究发现,PlexinAs Neuropilins关联,这种关联Sema 3s的信号转导是很重要的。进一步的研究发现许多其他Sema 3s的共同受体:L1cam、Nrcam、Plxnb1、和Plxnd1。除了Sema 3E,所有需要Neuropilin受体作为Sema 3s配体结合位点。作为绑定Sema 3s配体的Neuropilins取决于他们N-端某序列和一个70氨基酸序列才能确定其特异性。不同数量的Sema 3s多聚体受体,与之相关联的Plexins或细胞粘附分子提供了细胞内信号传导机制。Sema 3E不同之处在于,它能够直接绑定Plxnd1而缺乏Neuropilin。Plexins(A类,除了Sema 3E以外的Plxnd1 )和细胞粘附分子(L1cam和Nrcam)是通过横跨膜和细胞外域顺式相互作用于Nrp1和Nrp2。
.....................................
第 2 章 实验研究
2.1 体内试验
2.1.1 资料
2.1.1.1 研究对象
随机抽取自2009年12月至2010年5月内蒙古医科大学附属医院神经外科临床确诊手术切除的神经胶质瘤组织蜡块，术前均未经任何抗肿瘤治疗，术后病理诊断均为神经胶质瘤，其中Ⅰ级胶质瘤4例，Ⅱ级胶质瘤25例，Ⅲ级胶质瘤20例，Ⅳ级胶质瘤20例，男性36例，女性33例，男女性别之比为1.07:1，年龄17～70岁，平均48.37±12.06岁。所有切片均由专业技术人员切成5微米厚。另选取同期因急性颅脑损伤而颅内减压切除的正常脑组织3份作为对照组，液氮冻存备用。
2.1.1.2 抗体
购自福州迈新生物技术开发有限公司 UltraSensitiveTMS-P 超敏试剂盒（鼠/兔）。
2.1.1.3 主要试剂盒及试剂
UltraSensitiveTM SP 超敏试剂盒，中国福州迈新生物技术公司；
DAB 显色试剂盒，中国福州迈新生物技术开发公司；
质粒抽提试剂盒 ，生工生物工程(上海)股份有限公司提供，SK8161；
苏木素体细胞染色液，中国福州迈新生物技术开发公司；
DAB 显色试剂盒，中国福州迈新生物技术开发公司；
CpG Assay(200),Qiagen,Germany；
DNA 提取试剂盒，Qiagen,Germany；
DNA 亚硫酸氢钠修饰，Qiagen,Germany；
NaHSO3（分析纯，生工）；
PCR 产物纯化回收试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司提供，SK8141；
感受态细胞制备试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司提供，SK9307；
TaqDNA 聚合酶 SC0010 及 dNTP，笔耕文化传播，生工生物工程(上海)股份有限公司提供；
NaOH，生工生物工程(上海)股份有限公司提供；
氢醌，生工生物工程(上海)股份有限公司提供；
pUC18-T，生工生物工程(上海)股份有限公司提供；
.............................................
2.2 体外实验
胶质母细胞瘤（ Glioblastoma multiforme，GBM ）已被发现是最普遍和最重要的原发性恶性脑肿瘤，每年影响约 25,000 例病人的生存[172-173]。目前，治疗这种疾病包括手术切除和术后药物协作的放射治疗（ Radiotherapy，RT）。然而，患者的生存期仍然很短，据报道总生存期和术后 2 年生存率分别是 14.6 个月 26.5％[174]。微血管增生和弥漫性浸润是胶质瘤细胞的两大生物学特性，也是导致此病难以治愈的原因[175]。此外，因为肿瘤细胞浸润正常脑组织，因此，通过手术切除肿瘤细胞具有一定的挑战性[176]。目前，对于致命性的肿瘤细胞的具体治疗方案已经很多[177-179]。而且，对于不能进行手术或承受术后复发和转移的患者，可以考虑采用药物治疗在一定程度控制肿瘤生长。因此，有必要开发一种具有特异性针对靶细胞（癌细胞）、毒性低、安全以及较强的抗肿瘤效果的新药物，可进行 GBM 的治疗和预防复发以及转移。
布鲁生（Brucine）是一种无臭味的白色晶体。研究有发现，布鲁生具有抗肝癌肿瘤的作用[180]，而且，布鲁生抑肝癌细胞迁移和转移[181]。据报道，布鲁生抑制人肝癌细胞的生长[182-183]。因此，在本研究中，对含有不同浓度 Brucine 的培养体系中胶质母细胞瘤细胞 U251 的生存状态进行了解，这可为临床治疗以及实验理论提供基础。
..............................
第3章 结果 ..............................56-78
3.1 体内结果................................. 56-72
3.1.1 VEGF 在神经胶质瘤中的表达................... 56-57
3.1.2 VEGF 在各级胶质瘤中的统计学分析............................ 57-58
3.1.3 VEGF 表达与胶质瘤相关性分析.......................... 58-59
3.1.4 NRP-1 在神经胶质瘤中的表达 .............59-62
3.1.5 NRP-2 在神经胶质瘤中的表达 ...........................62-65
3.1.6 VEGF 和 NRP1/2 在神经胶质瘤中表达的相关性 ................65-66
3.1.7 神经胶质瘤患者信息及 IOD 值 ..........................66-68
3.1.8 SEMA 3B 基因启动子在神经胶质瘤中存在甲基化 ...................68-71
3.1.9 SEMA3B 的表达与神经胶质瘤临床病理特征和甲基化分类统计............................ 71-72
3.2 体外实验...................................... 72-78
3.2.1 电泳检测人胶质瘤细胞 U251 的总 RNA......................... 72-73
3.2.2 体外培养过程中人胶质瘤细胞U251 SEMA 3B、BCL-2、BAX mRNA的表达情况 .......................................73-76
3.2.3 不同浓度 Brucine 对人脑胶质瘤细胞 U251 细胞存活的影响............................... 76
3.2.4 不同浓度 Brucine 对 U251 细胞凋亡的影响........................... 76-78
第4章 讨论
新血管的生成是判断神经胶质瘤恶性程度、侵袭和预后的前提条件，肿瘤的生长需要靠新生血管来供应营养物质，那么新生血管就为肿瘤的发生发展提供了有用的营养物质。国外研究表明，恶性肿瘤血管形成中VEGF起着非常重要的作用，Struger等[11]对22例脑转移瘤组织进行免疫组化研究，结果21例VEGF染色阳性，胶质瘤细胞中检测出了VEGFmRNA及VEGF蛋白，二者的表达与胶质瘤的MVD均正相关（p<0.01）,而且随着胶质瘤的恶性程度增加，其水平越高，患者的预后越差。在脑胶质瘤中肿瘤分泌VEGF远远大于正常脑组织以及其他正常器官，甚至正常的脑组织中则无表达[12]。曾冉等[13]研究表明胶质瘤的VEGF表达水平与肿瘤的恶性度密切相关，即肿瘤的病理级别越高，肿瘤表达的VEGF水平越高。朱正权等[14]通过对94例胶质瘤组织石蜡标本进行VEGF的免疫组化分析，新疆地区汉族胶质瘤患者肿瘤的VEGF阳性率81．97％，并且与VEGF表达水平与肿瘤病理级别之间的呈显著正相关。苏君等[15]采用免疫组化SP二步法对24对初发低级别及复发、恶变后高级别胶质瘤标本分别进行VEGF的表达检测，表明VEGF、EGFR在低级别胶质瘤复发、恶变中起到非常重要的作用。即提示VEGF在胶质瘤中的表达越高，血管生长越旺盛，为肿瘤的侵袭生长提供了有利的条件，通过增加了血管的通透性，因而加速了肿瘤细胞的生长，促进了肿瘤的侵袭和转移，提示造成了肿瘤恶性程度的增高。VEGF能够依靠特异性生长因子在调节血管发生中起到重要作用，无论肿瘤内外都可以自分泌大量的VEGF，在肿瘤发生发展过程中，可以调节肿瘤的增值迁移、分化和凋亡等，还可以通过旁分泌影响肿瘤血管的生成。由于神经胶质瘤生长迅速，常常会导致营养障碍，使肿瘤本身缺血、缺氧、囊性变和坏死，缺氧又会刺激肿瘤本身VEGF的分泌增多。缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α），可以上调VEGF在神经胶质瘤中的表达，增加了神经胶质瘤的增殖迁移能力，随着神经胶质瘤分级的增加，HIF-1α和VEGF的表达也在增强[111、112]。这也与神经胶质瘤的恶性相关，符合临床属性，即恶性程度高的神经胶质瘤，在生长过程中侵润明显，对患者来说易复发和预后差。VEGF在神经胶质瘤中的高表达，说明了参与了神经胶质瘤的生长和侵袭过程，与新生血管生成有关，表明VEGF可以作为判断神经胶质瘤生物学活性的重要指标。
.........................................
结论
1. VEGF 和 NRP1/2 在神经胶质瘤的病理分级中的表达与神经胶质瘤的恶性程度成正相关，对神经胶质瘤的的发生发展及判断预后可能有相关性。
2. SEMA 3B 基因在神经胶质瘤的甲基化随着其病理级别的增加而增高，说明 SEMA3B 基因在神经胶质瘤中的表达水平与恶性程度呈正相关，其表达缺失越显著对神经胶质瘤患者预后影响较大。
3. LOH 可能是 SEMA 3B 基因在神经胶质瘤组织中表达的缺失或下调的重要分子机制之一。
4. Brucine 在浓度 0.6mol/ml 时，在体外能诱导胶质母细胞瘤细胞 U251 凋亡和抑制其迁移。
..............................
[1] Chen Liang,Shiwen Guo,Ling Yang. All-trans retinoic acid upregulates VEGF expression in glioma cells in vitro[J]. Journal of Biomedical Research. 2013(01)
[2] 曾冉,况建国,邓世钢,夏亮,邓圣泽,徐奖,杨全喜,公茂田. 人脑胶质瘤p53、p15、VEGF的表达及与恶性程度的相关分析[J]. 西安交通大学学报(医学版). 2013(03)
[3] 段泽星,谢立群. VEGF在肿瘤生长和血管生成中的作用[J]. 世界华人消化杂志. 2010(27)
[4] Theodore D Tsirlis,George Papastratis,Kyriaki Masselou,Christos Tsigris,Antonis Papachristodoulou,Alkiviadis Kostakis,Nikolaos I Nikiteas. Circulating lymphangiogenic growth factors in gastrointestinal solid tumors, could they be of any clinical significance?[J]. World Journal of Gastroenterology. 2008(17)
本文编号：10948
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/shenjingyixue/10948.html