重组大肠杆菌耐热肠毒素蛋白及其单克隆抗体的制备与初步应用

发布时间：2024-04-22 00:27

　　产肠毒素大肠杆菌(ETEC)耐热肠毒素(STa)是造成新生幼畜、发展中国家儿童和旅行者腹泻,甚至死亡的重要致病因子之一,给人类健康带来严重威胁,也给养猪业造成严重的经济损失。STa分子量小(约2Ku),很难获得天然纯品,且天然蛋白不具有免疫原性,无法被蛋白质染色剂染色,也不能直接包被到ELISA板上,因此无法采用SDS-PAGE法和ELISA方法对其进行直接检测。常规检测方法是乳鼠灌胃试验,不仅需要特定的实验动物,而且判定方法不够灵敏。因此,表达具有免疫原的重组蛋白STa,制备抗STa单克隆抗体,对STa快速检测方法的建立及免疫抗体检测都具有重要的理论和实际意义。STa分为STh(人源)和STp(猪源或牛源)两种亚型,本研究以STp为研究对象,表达了重组蛋白STp5-His,制备了抗STp单克隆抗体,初步建立了用于检测STa的间接竞争ELISA方法。重组蛋白STp5-His和MBP-5STp的表达。将estp基因进行4次串联,分别构建estp5-his和e5stp基因片段;将estp5-his和5STp分别插入pGEX-6P-1和pMAL-c4x载体,构建重组大肠杆菌 BL21(Ply...

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图３－１质粒ｐＵＣ５７■＾冲Ｆｉｇ．３－１?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｐｌａｓｍｉｄ?ｐ＼ＪＣ５１?－ｅｓｔｐ

对基因合成的质粒用ＢａｍＨＩ和Ｓａｉｌ双酶切鉴定。载体大小为ｐＵＣ５７?（２７００ｂｐ），目的??片段⑵（８７ｂｐ）和＾（ｌｌｌｂｐ），由于目的片段较小，所以核酸胶图谱只能隐约??看见，但大小于预期相符，见图３－１所示。??ｂｐ?Ｍ?１?２??ＢＭ．ＤＬ２０００?ｐｌｕｓ?ＩＩ分....

图３－２重组质粒ｐＵＣ５７－ｅ５冲

对基因合成的质粒用ＢａｍＨＩ和Ｓａｉｌ双酶切鉴定。载体大小为ｐＵＣ５７?（２７００ｂｐ），目的??片段⑵（８７ｂｐ）和＾（ｌｌｌｂｐ），由于目的片段较小，所以核酸胶图谱只能隐约??看见，但大小于预期相符，见图３－１所示。??ｂｐ?Ｍ?１?２??ＢＭ．ＤＬ２０００?ｐｌｕｓ?ＩＩ分....

图３－６纯化ＳＴｐ５－Ｈｉｓ蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析??Ｆｉｇ．３－６?ＳＤＳ－ＰＡＧＥ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ＳＴｐ５－Ｈｉｓ??

３．２．４重组蛋白ＳＴｐ５－Ｈｉｓ纯化??重组蛋白ＳＴｐ５－Ｈｉｓ经过切胶纯化，反复冻融后，离心收集上清，即为纯化蛋白，取少量??进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，见

图３－８抗重组蛋白ＭＢＰ－５ＳＴｐ卵黄抗体的Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ分析??Ｆｉｇ．３－８?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ａｎｔｉ－ＭＢＰ－５ＳＴｐ?ＩｇＹ??

对诱导后的重组大肠杆菌Ｒｏｓｅｔｔａ／ｐＭＡＬ－ｃＡｘ－ｄｓ／ｐ进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果显示，与??ｐＭＡＬ－ｃ４ｘ空载比对，目的蛋白大小约为５８Ｋｕ，主要以上清形式表达，命名为重组蛋白??ＭＢＰ－５ＳＴｐ，见图３－７。对重组蛋白进行Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ鉴定，在５８Ｋｕ....

本文编号：3961667