NK细胞产生生长促进因子的功能及机制研究
发布时间：2024-03-25 04:25
自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK cells)因其天然的杀伤能力而得名。从1975年的偶然发现到如今被免疫学家和临床医生寄予厚望,学界对NK细胞的认识经历了从最早CD56+CD3-简单表型描述到鉴定NK细胞是机体抗病毒和抗肿瘤的天然淋巴细胞重要亚群之一的漫长过程。NK细胞不仅是宿主防御中的“哨兵”,而且可以通过分泌细胞因子和趋化因子在维持组织稳态中发挥关键作用。体内成熟NK细胞数量的异常对肿瘤的发生发展,甚至是对自身免疫疾病发生都有重要影响。但是,目前无论是NK细胞功能分子的研究,还是促进NK细胞发育成熟调控因子的研究,仍主要局限于IFN-γ和IL-15等少数细胞因子。生长促进因子作为一类广泛表达且对于细胞发育成熟非常作用的细胞因子,在NK细胞的研究中鲜有报道。同时,NK细胞功能的研究仍主要集中于外周NK细胞在宿主防御中的作用,但是关于组织居留NK(Tissue-Resident NK,trNK)细胞的组织特异性功能报道甚少。人外周血中,NK细胞约占淋巴细胞总数的10%。但是在子宫组织中,随着妊娠反应的开始,子宫内膜迅速蜕膜化,NK细胞数量迅速增加,最高可达...
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论NK细胞发育和功能的研究进展
1.1 引言
1.2 NK细胞的研究简史
1.3 多组学联合分析助力NK细胞发育和功能的研究
1.3.1 基因组学分析
1.3.2 转录组学与蛋白质组学分析
1.3.3 多组学联合分析
1.4 NK细胞表型的多样性
1.5 NK细胞功能的多样性
1.5.1 NK细胞的抗肿瘤、抗病毒功能
1.5.2 NK细胞的免疫调节功能
1.5.3 NK细胞促进胚胎植入的功能
1.6 NK细胞的发育和成熟
1.6.1 NK细胞发育的微环境
1.6.2 NK细胞发育和成熟的程序化
1.6.3 细胞因子促进NK细胞发育和成熟
1.6.4 生长促进因子促进NK细胞发育和成熟
1.6.5 转录因子调控NK细胞发育和成熟
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 临床标本
2.1.2 实验动物
2.1.3 细菌培养及相关试剂
2.1.4 RNA体外转录质粒及相关试剂
2.1.5 质粒及抽提、转染试剂
2.1.6 细胞电核转试剂
2.1.7 细胞系及培养基
2.1.8 细胞因子及生长促进因子
2.1.9 抗体
2.1.10 细胞分离和纯化试剂
2.1.11 总RNA提取和RT-PCR试剂
2.1.12 核酸序列
2.1.13 PCR试剂和核酸电泳试剂
2.1.14 荧光定量PCR试剂
2.1.15 SDS-PAGE电泳和Western blotting试剂
2.1.16 免疫荧光及流式内标检测试剂
2.1.17 蛋白纯化试剂
2.1.18 NK细胞ChIP实验试剂
2.1.19 荧光素报告实验试剂
2.1.20 DNA-pull down实验试剂
2.2 实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 人单个核细胞分离及NK细胞纯化
2.3.2 小鼠组织单个核细胞分离
2.3.3 人NK细胞纯化及基因芯片数据分析
2.3.4 细胞总RNA提取和RT-PCR
2.3.5 荧光定量PCR
2.3.6 流式细胞术
2.3.7 免疫荧光实验
2.3.8 细胞干扰和过表达实验
2.3.9 基因编辑小鼠构建
2.3.10 NK细胞相关基因保守性分析
2.3.11 PBX1蛋白的表达和纯化
2.3.12 PBX1的抗体制备
2.3.13 人脐血干细胞纯化及NK细胞体外分化扩增
2.3.14 细胞Western blotting
2.3.15 NK细胞ChIP-Seq实验
2.3.16 荧光素酶报告实验
2.3.17 DNA-pull down实验
2.3.18 骨髓嵌合体小鼠模型
2.3.19 小鼠骨髓细胞混合转输模型
2.3.20 统计学分析
第三章 NK细胞产生生长促进因子促进胚胎发育
3.1 引言
3.2 基因芯片差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞
3.2.1 子宫NK细胞与外周NK细胞基因表达谱存在显著差异
3.2.2 子宫CD49a+NK细胞表达多种生长促进因子
3.3 子宫NK细胞分泌生长促进因子PTN和OGN
3.3.1 子宫CD49a+ NK细胞表达PTN和OGN等生长促进因子
3.3.2 子宫CD11b-CD27-NK细胞和trNK细胞表达生长促进因子
3.4 HLA-G诱导NK细胞分泌生长促进因子
3.4.1 HLA-G+绒毛外滋养层细胞促进NK细胞分泌生长促进因子
3.4.2 HLA-G-ILT2-KIR2DL4互作促进NK细胞分泌生长促进因子
3.5 异常发育的胚胎HLA-G表达量显著降低
3.6 反复流产病人NK细胞分泌生长促进因子能力显著降低
3.6.1 反复流产病人产生生长促进因子的NK细胞功能亚群显著减少
3.6.2 反复流产病人NK细胞表达生长促进因子的能力显著下降
3.7 Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育受限
3.7.1 Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠构建及验证
3.7.2 Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育受限
3.8 讨论与总结
第四章 PBX1促进NK细胞在骨髓中的发育成熟
4.1 引言
4.2 生长促进因子支持NK细胞成熟
4.2.1 NK细胞发育过程中表达生长促进因子
4.2.2 Ptn-/-Ogn-/-小鼠模型证明生长促进因子促进NK细胞在骨髓成熟
4.2.3 骨髓混合转输模型证明PTN和OGN促进NK细胞在骨髓成熟
4.2.4 骨髓成熟NK细胞表达生长促进因子受体RPTP-β
4.3 PBX1是NK细胞一个高度保守的转录因子
4.3.1 PBX1在物种进化过程中高度保守
4.3.2 PBX1在人骨髓NK细胞中高表达
4.3.3 PBX1在骨髓CD11b+单阳性NK细胞中高表达
4.4 PBX1促进NK细胞表达PTN和OGN
4.4.1 生物信息学预测PTN和OGN是PBX1的靶基因
4.4.2 在NK细胞中干扰PBX1表达抑制PTN和OGN表达
4.4.3 在NK细胞分化体系中过表达PBX1促进PTN和OGN表达
4.5 PBX1直接结合PTN和OGN启动子促进其转录
4.5.1 CHIP-seq结果证明在PTN和OGN启动子区有PBX1结合峰
4.5.2 荧光素酶报告实验验证PBX1结合PTN和OGN启动子区
4.5.3 DNA-pulldown验证PBX1结合PTN和OGN启动子中特异性序列
4.6 Pbx1缺陷小鼠NK细胞数量严重减少
4.6.1 骨髓嵌合体小鼠模型证明Pbx1促进NK细胞发育
4.6.2 Pbx1条件型敲除小鼠模型证明Pbx1促进NK细胞发育
4.7 PBX1促进NK细胞在骨髓的成熟
4.7.1 Pbx1条件型敲除小鼠模型证明PBX1促进NK细胞成熟
4.7.2 PTN/OGN恢复实验证明PBX1-PTN/OGN轴促进NK细胞成熟
4.8 PBX1-PTN/OGN轴通过上调T-bet表达促进NK细胞成熟
4.8.1 PBX1-PTN/OGN轴促进骨髓NK细胞的增殖和迁出骨髓能力
4.8.2 PBX1-PTN/OGN轴上调骨髓NK细胞转录因子T-bet的表达
4.9 讨论与总结
参考文献
致谢
攻读博士学位期间的主要研究成果
附录
本文编号：3938536
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论NK细胞发育和功能的研究进展
1.1 引言
1.2 NK细胞的研究简史
1.3 多组学联合分析助力NK细胞发育和功能的研究
1.3.1 基因组学分析
1.3.2 转录组学与蛋白质组学分析
1.3.3 多组学联合分析
1.4 NK细胞表型的多样性
1.5 NK细胞功能的多样性
1.5.1 NK细胞的抗肿瘤、抗病毒功能
1.5.2 NK细胞的免疫调节功能
1.5.3 NK细胞促进胚胎植入的功能
1.6 NK细胞的发育和成熟
1.6.1 NK细胞发育的微环境
1.6.2 NK细胞发育和成熟的程序化
1.6.3 细胞因子促进NK细胞发育和成熟
1.6.4 生长促进因子促进NK细胞发育和成熟
1.6.5 转录因子调控NK细胞发育和成熟
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 临床标本
2.1.2 实验动物
2.1.3 细菌培养及相关试剂
2.1.4 RNA体外转录质粒及相关试剂
2.1.5 质粒及抽提、转染试剂
2.1.6 细胞电核转试剂
2.1.7 细胞系及培养基
2.1.8 细胞因子及生长促进因子
2.1.9 抗体
2.1.10 细胞分离和纯化试剂
2.1.11 总RNA提取和RT-PCR试剂
2.1.12 核酸序列
2.1.13 PCR试剂和核酸电泳试剂
2.1.14 荧光定量PCR试剂
2.1.15 SDS-PAGE电泳和Western blotting试剂
2.1.16 免疫荧光及流式内标检测试剂
2.1.17 蛋白纯化试剂
2.1.18 NK细胞ChIP实验试剂
2.1.19 荧光素报告实验试剂
2.1.20 DNA-pull down实验试剂
2.2 实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 人单个核细胞分离及NK细胞纯化
2.3.2 小鼠组织单个核细胞分离
2.3.3 人NK细胞纯化及基因芯片数据分析
2.3.4 细胞总RNA提取和RT-PCR
2.3.5 荧光定量PCR
2.3.6 流式细胞术
2.3.7 免疫荧光实验
2.3.8 细胞干扰和过表达实验
2.3.9 基因编辑小鼠构建
2.3.10 NK细胞相关基因保守性分析
2.3.11 PBX1蛋白的表达和纯化
2.3.12 PBX1的抗体制备
2.3.13 人脐血干细胞纯化及NK细胞体外分化扩增
2.3.14 细胞Western blotting
2.3.15 NK细胞ChIP-Seq实验
2.3.16 荧光素酶报告实验
2.3.17 DNA-pull down实验
2.3.18 骨髓嵌合体小鼠模型
2.3.19 小鼠骨髓细胞混合转输模型
2.3.20 统计学分析
第三章 NK细胞产生生长促进因子促进胚胎发育
3.1 引言
3.2 基因芯片差异分析子宫trNK细胞和外周血NK细胞
3.2.1 子宫NK细胞与外周NK细胞基因表达谱存在显著差异
3.2.2 子宫CD49a+NK细胞表达多种生长促进因子
3.3 子宫NK细胞分泌生长促进因子PTN和OGN
3.3.1 子宫CD49a+ NK细胞表达PTN和OGN等生长促进因子
3.3.2 子宫CD11b-CD27-NK细胞和trNK细胞表达生长促进因子
3.4 HLA-G诱导NK细胞分泌生长促进因子
3.4.1 HLA-G+绒毛外滋养层细胞促进NK细胞分泌生长促进因子
3.4.2 HLA-G-ILT2-KIR2DL4互作促进NK细胞分泌生长促进因子
3.5 异常发育的胚胎HLA-G表达量显著降低
3.6 反复流产病人NK细胞分泌生长促进因子能力显著降低
3.6.1 反复流产病人产生生长促进因子的NK细胞功能亚群显著减少
3.6.2 反复流产病人NK细胞表达生长促进因子的能力显著下降
3.7 Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育受限
3.7.1 Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠构建及验证
3.7.2 Ptn-/-Ogn-/-Spp1-/-小鼠胚胎发育受限
3.8 讨论与总结
第四章 PBX1促进NK细胞在骨髓中的发育成熟
4.1 引言
4.2 生长促进因子支持NK细胞成熟
4.2.1 NK细胞发育过程中表达生长促进因子
4.2.2 Ptn-/-Ogn-/-小鼠模型证明生长促进因子促进NK细胞在骨髓成熟
4.2.3 骨髓混合转输模型证明PTN和OGN促进NK细胞在骨髓成熟
4.2.4 骨髓成熟NK细胞表达生长促进因子受体RPTP-β
4.3 PBX1是NK细胞一个高度保守的转录因子
4.3.1 PBX1在物种进化过程中高度保守
4.3.2 PBX1在人骨髓NK细胞中高表达
4.3.3 PBX1在骨髓CD11b+单阳性NK细胞中高表达
4.4 PBX1促进NK细胞表达PTN和OGN
4.4.1 生物信息学预测PTN和OGN是PBX1的靶基因
4.4.2 在NK细胞中干扰PBX1表达抑制PTN和OGN表达
4.4.3 在NK细胞分化体系中过表达PBX1促进PTN和OGN表达
4.5 PBX1直接结合PTN和OGN启动子促进其转录
4.5.1 CHIP-seq结果证明在PTN和OGN启动子区有PBX1结合峰
4.5.2 荧光素酶报告实验验证PBX1结合PTN和OGN启动子区
4.5.3 DNA-pulldown验证PBX1结合PTN和OGN启动子中特异性序列
4.6 Pbx1缺陷小鼠NK细胞数量严重减少
4.6.1 骨髓嵌合体小鼠模型证明Pbx1促进NK细胞发育
4.6.2 Pbx1条件型敲除小鼠模型证明Pbx1促进NK细胞发育
4.7 PBX1促进NK细胞在骨髓的成熟
4.7.1 Pbx1条件型敲除小鼠模型证明PBX1促进NK细胞成熟
4.7.2 PTN/OGN恢复实验证明PBX1-PTN/OGN轴促进NK细胞成熟
4.8 PBX1-PTN/OGN轴通过上调T-bet表达促进NK细胞成熟
4.8.1 PBX1-PTN/OGN轴促进骨髓NK细胞的增殖和迁出骨髓能力
4.8.2 PBX1-PTN/OGN轴上调骨髓NK细胞转录因子T-bet的表达
4.9 讨论与总结
参考文献
致谢
攻读博士学位期间的主要研究成果
附录
本文编号：3938536
本文链接：https://www.wllwen.com/xiyixuelunwen/3938536.html