两种纳米抗体在不同表达系统中表达的比较研究

发布时间：2024-02-13 21:46

　　纳米抗体(nanobody)是一种新型的小分子抗体片段,由驼类天然的重链抗体重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy chain antibodies,VHH)克隆获得。分子量是完整抗体的十分之一,具有优良的生物学特性,拥有完整的抗原结合位点、耐恶劣条件(如低p H,高温)和低免疫原性、很好的组织穿透性,特异性高,水溶性好。工程化单克隆抗体片段由于其多功能性和潜力而受到市场关注,被认为是未来免疫诊断和治疗的药物重要组成部分并具备较为广阔的发展前景。相同纳米抗体在不同表达系统中的表达方法以及表达质量,目前并没有得到系统深入的研究。本论文选取7D12和9G8两种纳米抗体,在大肠杆菌和毕赤酵母两种表达系统中分别表达进而比较差异,通过这种比较,为纳米抗体的工业化大规模生产奠定了基础。研究的具体内容如下:本论文利用基因工程方法,分别构建适合大肠杆菌系统表达的PET28a-7D12/PET28a-9G8重组质粒以及适合毕赤酵母表达系统的p GAPZa A-7D12/p GAPZa A-9G8重组质粒,为后续表达蛋白提供基础。本论文首先对纳米抗体7D...

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【学位级别】：硕士

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中文摘要
abstract
第一章 绪论
    1.1 纳米抗体(Nanobody,Nb)研究进展
        1.1.1 纳米抗体
        1.1.2 纳米抗体的优势
        1.1.3 纳米抗体的应用
        1.1.4 纳米抗体7D12
        1.1.5 纳米抗体9G8
    1.2 纳米抗体的表达系统
        1.2.1 大肠杆菌表达系统
        1.2.2 毕赤酵母表达系统
第二章 表达载体的构建
    2.1 实验仪器与试剂
        2.1.1 实验仪器
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 试剂配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 设计合成及PCR扩增
        2.2.2 纯化和电泳鉴定
        2.2.3 质粒的酶切与连接
        2.2.4 连接产物的转化及鉴定
    2.3 实验结果
        2.3.1 目的片段的PCR扩增
        2.3.2 质粒的酶切与连接
        2.3.3 重组质粒的鉴定
第三章 纳米抗体在不同表达系统中表达及鉴定
    3.1 实验仪器与试剂
        3.1.1 实验仪器
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 试剂配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 转化X33酵母及表达蛋白的纯化与鉴定
        3.2.2 转化大肠杆菌BL21及蛋白的表达
        3.2.3 变复性及样品纯化与鉴定
    3.3 实验结果
        3.3.1 转化X33酵母及表达蛋白的纯化与鉴定
        3.3.2 转化大肠杆菌BL21及表达蛋白的纯化与鉴定
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 纳米抗体的中试发酵放大生产及纯化鉴定
    4.1 实验仪器与试剂
        4.1.1 实验仪器
        4.1.2 实验试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 7D12蛋白中试发酵
            4.2.1.1 制备种子液
            4.2.1.2 目的蛋白的中试发酵生产
            4.2.1.3 诱导表达阶段
            4.2.1.4 中试发酵的鉴定
            4.2.1.5 发酵液初处理
        4.2.2 7D12蛋白纯化
            4.2.2.1 Ni-NTA填料装柱
            4.2.2.2 Ni-NTA柱再生步骤
            4.2.2.3 AKTA纯化步骤
            4.2.2.4 纯化得到的蛋白样品处理
        4.2.3 纯化样品检测
            4.2.3.1 液相色谱检测
            4.2.3.2 BCA蛋白定量
            4.2.3.3 PPSQ-51A蛋白质测序
            4.2.3.4 飞行时间质谱检测
    4.3 实验结果
        4.3.1 中试发酵电泳鉴定结果
        4.3.2 AKTA纯化电泳及液相检测结果
        4.3.3 蛋白纯化液相色谱图
        4.3.4 BCA定量检测结果
        4.3.5 PPSQ-51A蛋白质测序结果
        4.3.6 飞行质谱检测结果
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 结论
参考文献
致谢



本文编号：3897256