Der f1的T细胞表位疫苗对哮喘小鼠的特异性免疫治疗及对STAT4/STAT6信号通路的影响

发布时间：2024-02-01 12:28

　　目的：探讨以粉尘螨Der f 1的T细胞表位融合肽为疫苗对过敏性哮喘小鼠进行特异性免疫治疗的效果和对STAT4/STAT6信号通路的影响。方法：将Derf 1的8段T细胞表位,按照T1-T2-T3-T4-T5-T6-T7-T8连接方式合成融合肽,命名为Derf IT。将上述融合基因克隆到pET28a(+)中,构建pET28a(+)-Der f 1 T重组载体,用限制性内切酶验证,将pET28a(+)-Der f 1 T重组载体转入E. coli BL21(DE3)中,用不同浓度的IPTG小剂量诱导表达Der f 1 T,确定出最适浓度,然后在最适IPTG浓度条件下进行Derf IT的大剂量表达并纯化。制样进行SDS-PAGE、Western bloting鉴定分析表达的蛋白。以粉尘螨粗提液为致敏原,构建小鼠过敏性哮喘模型,30只小鼠按每组10只随机分为三组,PBS组、哮喘组和免疫治疗组。以纯化的Der f 1 T细胞表位融合肽为疫苗对哮喘小鼠模型进行特异性免疫治疗。处死小鼠,分别收集每组小鼠的标本。应用ELISA法检测脾细胞培养上清和BALF中细胞因子IL-13和IFN-y含量及血清中...

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
主要仪器
注释说明清单
引言
第一部分 粉尘螨1类变应原T细胞表位重组蛋白的构建及鉴定
    1 研究内容
        1.1 合成基因
        1.2 设计引物
        1.3 构建重组表达质粒
    2 材料与方法
        2.1 主要试剂
        2.2 主要试剂配制
    3 实验方法
        3.1 Derf1T细胞表位嵌合基因的制备
        3.2 重组表达质粒的构建
        3.3 重组质粒的提取
        3.4 重组质粒双酶切鉴定
        3.5 E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备及转化
        3.6 菌落PCR验证
        3.7 DNA测序测定
        3.8 Derf1,Derf1T蛋白的小量诱导表达
        3.9 Derf1,Derf1T蛋白的SDS-PAGE分析
        3.10 Derf1,Derf1T蛋白的大剂量诱导表达
        3.11 Derf1,Derf1T蛋白的纯化及鉴定
        3.12 纯化产物的免疫印记(western blot)分析
        3.13 患者血清IgE结合活性检测
    4 结果
        4.1 PCR扩增结果
        4.2 重组质粒鉴定
        4.3 重组蛋白表达与纯化
        4.4 免疫印迹实验鉴定Western blotting
        4.5 Derf1T对患者血清IgE结合力
    讨论
第二部分 Derf1的T细胞表位疫苗的治疗效果和对STAT4/STAT6信号通路的影响
    1 研究内容
    2 材料
        2.1 实验动物
        2.2 主要试剂
        2.3 主要仪器设备
        2.4 主要试剂配制
    3 方法
        3.1 建立哮喘小鼠模型
        3.2 特异性免疫治疗
        3.3 制备支气管肺泡灌洗液(BALF)并进行细胞因子检测
        3.4 测定血清中特异性IgE(sIgE)和IgG2a水平
        3.5 培养脾细胞并测定培养上清中细胞因子水平
        3.6 制作肺组织病理切片
        3.7 提取肺组织蛋白
        3.8 Western bloting分析
        3.9 统计学分析
    4 结果
        4.1 肺组织病理切片检查结果
        4.2 BALF中嗜酸性粒细胞计数
        4.3 BALF中细胞因子IL-13和IFN-γ含量测定
        4.4 血清中特异性IgE(sIgE)和IgG2a水平测定
        4.5 脾细胞培养上清中IL-13和IFN-γ含量测定
        4.6 肺组织中STAT4/STAT6蛋白表达变化
    讨论
结论
参考文献
作者简介及读研期间主要科研成果
致谢



本文编号：3892115