弓形虫二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶-ROP17真核表达载体的构建及ROP17参与自噬的研究

发布时间：2023-05-04 02:46

　　目的构建刚地弓形虫二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶(dihydrofolate reductase-thymidylate synthase,DHFRTS)-棒状体蛋白17真核表达载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17,将其转染人胚肾细胞(HEK 293T)后观察ROP17对细胞自噬的作用。方法以弓形虫速殖子总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增DHFR-TS基因片段,克隆至真核表达载体pIRES的多克隆位点B,构建重组质粒pIRES/TgDHFR-TS。经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染人胚肾细胞(HEK 293T),RT-PCR法和Western blot检测DHFR-TS的表达。以弓形虫速殖子cDNA为模板,PCR获得ROP17,将其引入重组质粒pIRES/TgDHFR-TS的多克隆位点A,构建重组载体pIRES/TgDHFR-TSTgROP17。重组载体经菌液PCR、双酶切和测序鉴定后转染人胚肾细胞(HEK 293T),对转染细胞血清饥饿诱导,通过Western blot检测自噬标志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62的表达。结果 RT-...

【文章页数】：7 页

【文章目录】：
材料与方法
    1 材料
        1.1 虫株、质粒、细胞株和菌株
        1.2 主要试剂
    2 方法
        2.1 pIRES/TgDHFR-TS的构建
            2.1.1 逆转录PCR(RT-PCR）引物的设计和合成
            2.1.2 TgDHFR-TS基因的扩增
            2.1.3 重组表达载体pIRES/TgDHFR-TS的构建及鉴定
        2.2 pIRES/TgDHFR-TS转染细胞
        2.3 RT-PCR和Western blot检测TgDHFR-TS基因和蛋白的表达
        2.4 pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17的构建
            2.4.1
            2.4.2 重组表达载体及鉴定
        2.5 pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17转染细胞
        2.6 RT-PCR和Western blot检测TgDHFR-TS-TgROP17基因和蛋白的表达
        2.7 Western blot检测血清饥饿诱导细胞自噬
        2.8 统计学分析
结果
    1 TgDHFR-TS基因的扩增
    2 pIRES/TgDHFR-TS真核表达载体的构建与鉴定
    3 真核表达载体pIRES/TgDHFR-TS在真核细胞中的表达
    4 TgROP17基因的扩增
    5 重组表达载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17的构建及鉴定
    6 真核表达载体pIRES/TgDHFR-TS-TgROP17在真核细胞中的表达
    7 血清饥饿诱导细胞自噬结果
讨论



本文编号：3807795