PR8F/NS1不同位点突变株对小鼠致病性的比较研究

发布时间：2023-04-04 01:51

　　为了探索NS1不同位点突变对流感病毒毒力的影响以及NS1毒力相关位点的作用机制。分析流感病毒NS1蛋白的毒力相关关键基因区段和关键位点,以实验室保存的H1N1亚型流感病毒PR8F为模板,对其NS1基因的第42、81、149位氨基酸分别进行定点突变。利用反向遗传操作技术,成功拯救出突变毒株PR8F-42、PR8F-81、PR8F-149。将获救病毒接种SPF鸡胚,连续传代5代,至病毒能够稳定扩增后,通过血凝效价分析病毒复制效率。并将获救病毒与PR8F均以106 TCID50/100μL感染BALB/c小鼠,观察各组小鼠临床表现、体重变化及存活率。剖检攻毒后死亡小鼠,观察病理特征,制作肺组织病理切片。并提取小鼠肺脏RNA,通过qPCR检测各组小鼠肺脏的病毒载量。结果表明,PR8F的NS1蛋白第42位氨基酸由丝氨酸(Ser)改变为脯氨酸(Pro)对小鼠的致病性无明显改变。第81位、149位氨基酸突变则都能减弱突变株对小鼠的致病性,进而为研究NS1毒力相关位点的作用机制提供平台。

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【文章目录】：
材料与方法
    1病毒株与细胞系
    2主要试剂及实验设备
    3鸡胚及实验动物
    4 NS不同位点突变质粒的构建
        4.1突变引物的设计
        4.2 PCR的体系与条件
        4.3 PCR产物的消化
        4.4转化
        4.5突变质粒测序鉴定
    5 PR8F流感病毒突变株的拯救
    6拯救病毒的扩增及鉴定
        6.1拯救病毒感染MDCK细胞及传代
        6.2拯救病毒的血凝效价测定
        6.3拯救病毒的TCID50测定
    7 PR8F各突变病毒对BALB/C小鼠致病性的比较
        7.1在SPF鸡胚中的扩增
        7.2感染BALB/c小鼠
        7.3样品采集与处理
        7.4 QPCR检测各突变病毒在感染小鼠肺脏内的病毒载量
结果
    1病毒的TCID50及血凝效价
    2小鼠剖检结果
    3肺组织病变差异分析
    4小鼠感染不同位点突变病毒后体重变化
    5不同位点突变病毒对小鼠的致死率
    6小鼠感染各突变病毒后肺脏内的病毒载量比较
讨论



本文编号：3781554