免酶核酸电路的构建及在生物医学中的应用研究

发布时间：2024-04-09 06:07

　　发展高灵敏和高特异性的分子探针用于生化分析、肿瘤的早期诊断及治疗具有重大意义。然而在实际工作中常常出现以下两个问题:(1)对于检测靶标含量较低的生物样品,常因灵敏度不够而检测不到,从而出现假阴性信号;(2)复杂生物检测环境的干扰如血清乃至细胞中酶等对探针的降解、非靶分子对探针的激活,基于单靶标识别而构建的检测体系引起的脱靶效应等,从而造成假阳性信号。免酶(特指免蛋白酶)核酸电路作为一种基于核酸杂交的信号放大形式,它将所需要的信息编码在设计好的核酸序列中,在各种靶标如核酸,蛋白质,小分子等的触发下启动一系列的杂交反应,最终输出信号。它不需要蛋白酶的参与、恒温、反应条件温和,因此在生物医学中显示出独特优势及重要应用价值。基于此,本论文针对上述存在的“假阴性”和“假阳性”两大关键性问题,以提高探针在复杂生物环境中的灵敏度、抗干扰能力和精准度,以及构建诊疗一体化探针为目标,利用免酶核酸放大电路为主要检测手段,结合金纳米颗粒(AuNPs)比色、荧光共振能量转移(FRET)等技术,设计和构建多种新型检测探针及分析方法,用于重要生物分子的高灵敏、高特异性检测,以及肿瘤细胞的精准鉴别和杀伤。具体研究内...

【文章页数】：144 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
本文所用英文缩写词表
第1章 绪论
    1.1 核酸电路概述
        1.1.1 核酸电路的定义及性质
        1.1.2 核酸电路的分类
    1.2 核酸电路的主要应用
        1.2.1 核酸电路在分析传感中的应用
        1.2.2 核酸电路在肿瘤治疗中的应用
    1.3 本文构思
第2章 杂交链式反应驱动的金颗粒组装用于比色放大检测DNA
    2.1 前言
    2.2 实验部分
        2.2.1 试剂与仪器
        2.2.2 缓冲溶液的制备
        2.2.3 探针准备
        2.2.4 金纳米颗粒的合成与表征
        2.2.5 金纳米颗粒的修饰
        2.2.6 琼脂糖电泳分析
        2.2.7 比色分析检测DNA
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 实验原理
        2.3.2 不同粒径AuNPs的表征及优化
        2.3.3 可行性考察
        2.3.4 灵敏度考察
        2.3.5 特异性考察
    2.4 小结
第3章 催化发夹组装驱动的金颗粒组装用于高灵敏比色检测腺苷
    3.1 前言
    3.2 实验部分
        3.2.1 试剂与仪器
        3.2.2 缓冲溶液的配制
        3.2.3 AuNPs的合成及修饰
        3.2.4 琼脂糖凝胶电泳表征
        3.2.5 比色分析传感
        3.2.6 TEM成像
        3.2.7 细胞裂解液的制备
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 实验原理与电泳验证
        3.3.2 AuNPs的合成及修饰
        3.3.3 DNA触发的CHA的检测性能
        3.3.4 腺苷检测的探针浓度优化
        3.3.5 腺苷检测的灵敏度及特异性考察
        3.3.6 复杂样品中的检测
    3.4 小结
第4章 催化发夹组装-杂交链式反应级联用于高灵敏检测DNA及腺苷
    4.1 前言
    4.2 实验部分
        4.2.1 试剂与仪器
        4.2.2 缓冲溶液的配制
        4.2.3 琼脂糖凝胶电泳分析
        4.2.4 荧光光谱测量
        4.2.5 HPLC测定
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 实验原理
        4.3.2 分步电路验证
        4.3.3 CHA-HCR级联电路检测DNA
        4.3.4 二元探针,HCR电路,级联电路检测性能比较
        4.3.5 CHA-HCR级联电路检测腺苷
    4.4 小结
第5章 双miRNA调控的脱氧核酶-杂交链式反应级联用于癌细胞的精准识别
    5.1 前言
    5.2 实验部分
        5.2.1 试剂与仪器
        5.2.2 缓冲溶液的配制
        5.2.3 细胞培养与探针的转染
        5.2.4 琼脂糖凝胶电泳表征
        5.2.5 荧光分析
        5.2.6 共聚焦成像
        5.2.7 流式细胞术分析
        5.2.8 反转录PCR分析
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 实验原理
        5.3.2 信号激活式核酶电路的验证
        5.3.3 基于FRET的 HCR电路验证
        5.3.4 级联逻辑电路的验证
        5.3.5 级联电路用于肿瘤细胞的成像考察
        5.3.6 级联电路用于肿瘤细胞的流式特异性考察
    5.4 小结
第6章 双RNA控制的杂交链式反应-脱氧核酶级联用于癌细胞的精准诊断及基因治疗
    6.1 前言
    6.2 实验部分
        6.2.1 试剂与仪器
        6.2.2 缓冲溶液的配制
        6.2.3 细胞培养与探针的转染
        6.2.4 琼脂糖凝胶电泳表征
        6.2.5 荧光分析
        6.2.6 FBS中稳定性考察
        6.2.7 共聚焦成像
        6.2.8 反转录PCR分析
        6.2.9 Western blot分析
        6.2.10 MTS分析
        6.2.11 Annexin V-FITC细胞凋亡检测
    6.3 结果与讨论
        6.3.1 实验原理
        6.3.2 HCR电路表征
        6.3.3 10-23核酶切割电路的验证
        6.3.4 细胞内miR-21成像
        6.3.5 EGR-1mRNA切割诱导的细胞凋亡的验证
        6.3.6 双RNA控制的基因治疗的特异性
    6.4 小结
结论
参考文献
附录 攻读博士学位期间所发表的学术论文
致谢



本文编号：3949434