基于MDM4 rs4245739位点探讨癌症与环境的关系及TRAIL通路抗癌机制的研究

发布时间：2023-07-28 10:24

　　根据GLOBOCAN的相关数据显示,癌症发病率和死亡率在世界范围内迅猛增长。同时,遗传学和流行病学的研究发现,癌症的发生与基因变异及生活环境相关。例如,紫外辐射以及烟雾可以诱导TP53、CDKN2A、RAC1等基因变异,从而增加黑色素瘤和肺癌的风险指数。因此,从遗传变异和环境的角度综合探讨癌症发生、发展对今后癌症的预防与治疗十分必要。研究发现TP53及其负控因子MDM2的调控网络与癌症风险指数显著相关。在东亚人群中,TP53 SNP rs1042522G的频率与冬季最低气温呈负相关,MDM2SNP rs2279744G的频率与紫外线辐射强度呈负相关,这提示该地区人群肺癌、乳腺癌以及眼癌的易感性与环境因素之间密切相关,为解释人群癌症的发生提供了群体遗传学证据。与MDM2类似,另一个负调控因子MDM4在癌症中突变较罕见,且高表达于多种癌症之中,其中rs4245739A与东亚人群肺癌、乳腺癌等癌症风险的增加显著相关。然而,MDM4癌症易感性相关SNP位点与环境因素相关性的研究鲜见报道。基于此,本项研究调查了64个东亚群体,总计3694个个体的rs4245739的基因型,发现易感位点rs424...

【文章页数】：127 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略语
第一章 绪论
    1.1 癌症的现状
    1.2 遗传因素以及环境差异与癌症的关系
    1.3 癌症的预防和化学治疗
    1.4 展望
第二章 东亚人群rs4245739 位点与环境因素关系的研究
    2.1 引言
    2.2 实验试剂与设备
        2.2.1 实验试剂
        2.2.2 实验仪器设备
        2.2.3 试剂配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 人血液基因组DNA的提取
        2.3.2 SNaPshot法对rs4245739 进行分型
            2.3.2.1 引物设计
            2.3.2.2 PCR扩增含有rs424539 的片段
            2.3.2.3 PCR产物的纯化
            2.3.2.4 单碱基引物延伸反应(SNaPshot反应)
            2.3.2.5 SNaPshot产物的纯化
            2.3.2.6 测序结果的检测与判读
        2.3.3 测序验证rs4245739 分型结果
            2.3.3.1 PCR扩增含有rs424539 的片段
            2.3.3.2 PCR产物的纯化
            2.3.3.3 测序PCR反应
            2.3.3.4 测序反应产物纯化
        2.3.4 环境因素数据的搜集
        2.3.5 数据的处理
            2.3.5.1 rs4245739 基因频率的计算
            2.3.5.2 采样点样本Hardy-Weinberg平衡检验
            2.3.5.3 rs4245739A频率与自然因素相关性分析
    2.4 实验结果
        2.4.1 采样点分布与民族种类
        2.4.2 rs4245739A频率、自然因素及Hardy-Weiberg平衡结果
        2.4.3 rs4245739A频率与环境因素相关性分析结果
    2.5 讨论
第三章 化合物3u在黑色素瘤细胞A375 中激活TRAIL通路抗癌机制的研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料与设备
        3.2.1 实验材料
            3.2.1.1 所用细胞系
            3.2.1.2 主要实验试剂
        3.2.2 主要实验仪器及设备
        3.2.3 试剂配制
    3.3 实验方法
        3.3.1 化合物库3 的来源
        3.3.2 细胞培养
            3.3.2.1 细胞复苏
            3.3.2.2 细胞传代
            3.3.2.3 细胞冻存
            3.3.2.4 Pulp细胞的原代培养
        3.3.3 MTT实验
        3.3.4 化合物3u抗癌作用生效时间的检测
        3.3.5 克隆形成实验
        3.3.6 蛋白样品的制备
            3.3.6.1 细胞总蛋白的提取
            3.3.6.2 细胞线粒体蛋白的提取
            3.3.6.3 细胞膜蛋白的提取
            3.3.6.4 BCA法测定蛋白浓度
        3.3.7 蛋白质免疫印迹western blot
            3.3.7.1 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳
            3.3.7.2 转膜
            3.3.7.3 免疫学检测
        3.3.8 实时荧光定量PCR(qPCR)
            3.3.8.1 细胞总RNA的提取
            3.3.8.2 cDNA第一链合成
            3.3.8.3 实时荧光定量PCR
            3.3.8.4 数据处理
    3.4 实验结果
        3.4.1 化合物库3 的化学结构与物理性质
        3.4.2 化合物库3 抗癌活性初筛结果
        3.4.3 三种候选化合物的复筛结果
        3.4.4 3u处理A375 克隆形成的结果
        3.4.5 3u诱导细胞死亡时间和浓度的探索
        3.4.6 3u抗癌作用与内源性凋亡途径的关系
        3.4.7 较高浓度3u可能的抗癌机制
        3.4.8 外源性凋亡信号的来源
        3.4.9 3u上调TNFRSF和 FADD表达的机制
        3.4.10 较低浓度3u可能的抗癌机制
        3.4.11 使用抑制剂再验证3u的抗癌机制
    3.5 讨论
第四章 三药联用提高癌细胞对TRAIL敏感性的研究
    4.1 引言
    4.2 实验材料与设备
        4.2.1 实验材料
            4.2.1.1 所用的质粒
            4.2.1.2 主要实验试剂
    4.3 实验方法
        4.3.1 敲低c-FLIP质粒的制备及转染
        4.3.2 caspase-3 活性测定
    4.4 实验结果
        4.4.1 抑制剂作用条件的优化
        4.4.2 三药联用诱导U2OS细胞凋亡的分子机制
        4.4.3 三药联用对多种癌细胞系的抗癌效果
        4.4.4 三药联用在正常细胞中的效果
        4.4.5 三药联用不敏感的癌细胞逃逸凋亡
        4.4.6 癌细胞凋亡敏感性的恢复
    4.5 讨论
第五章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 创新点
    5.3 展望
致谢
参考文献
附表
附录



本文编号：3837733