Cryptococcus heimaeyensis S20胞外多糖CHEPS诱导非小细胞肺癌细胞死亡及分子机制研究

发布时间：2023-07-26 20:51

　　肺癌发病率和死亡率位于世界上各癌症之首,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌总数的80%,存活率很低。化疗、靶向治疗和免疫治疗是晚期肺癌的主要治疗手段,然而这些手段的有效性有限、毒副作用大,这大大降低了病人的生活质量。因此,发展新型高效的、低毒的抗肿瘤药物意义重大。本研究中我们从南极分离的隐球酵母Cryptococcus heimaeyensis S20中提取了胞外多糖,并对它在非小细胞肺癌中的抗肿瘤活性和机制进行了初步研究。隐球酵母属广泛分布在寒冷干旱的环境中,主要靠产生胞外多糖等方式来保护自己。菌株Cryptococcus heimaeyensis S20是从南极洲分离的,到目前为止,其胞外多糖(CHEPS)的结构和相关生物活性还没有被系统研究过。在本研究中,我们发现CHEPS能够有效抑制NSCLC细胞活性,而对正常的人胚肺成纤维细胞WI-38和MRC-5的抑制效果较弱。进一步的研究发现,CHEPS通过上调周期调控蛋白p53和p21的表达以及下调Cyclin B1、CDK1、Cyclin A2和CDK2的表达,有效诱导了NSCLC细...

【文章页数】：128 页

【学位级别】：博士

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论文创新点
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 肺癌
        1.1.1 流行病学与分类
        1.1.2 临床表现与病因
        1.1.3 诊断
        1.1.4 分期
        1.1.5 治疗
        1.1.6 化学药物治疗
        1.1.7 靶向药物治疗
        1.1.8 免疫治疗
    1.2 胞外多糖
        1.2.1 概述
        1.2.2 多糖的应用
        1.2.3 多糖的抗肿瘤活性
        1.2.4 隐球酵母胞外多糖研究进展
    1.3 细胞自噬
        1.3.1 定义与分类
        1.3.2 具体阶段及相关调控基因
        1.3.3 自噬与细胞命运
        1.3.4 细胞自噬与癌症
        1.3.5 细胞自噬相关信号通路
        1.3.6 细胞自噬的检测技术
    1.4 本研究的目的和意义
2 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞系和菌株
        2.1.2 实验动物
        2.1.3 试剂与耗材
        2.1.4 抗体
        2.1.5 质粒
        2.1.6 主要实验仪器
        2.1.7 主要试剂的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 pEGFP-LC3过表达质粒的构建
        2.2.2 pSUPER-shRNA干扰质粒的构建
        2.2.3 细胞基本操作
        2.2.4 干扰质粒稳定细胞系的构建
        2.2.5 细胞总RNA的提取及实时荧光定量PCR
        2.2.6 Western Blot蛋白免疫印迹实验
        2.2.7 细胞活性检测
        2.2.8 克隆形成率检测
        2.2.9 细胞周期检测
        2.2.10 细胞凋亡检测
        2.2.11 细胞自噬检测
        2.2.12 活性氧(ROS)检测
        2.2.13 组织病理学和免疫组化检测
        2.2.14 动物实验方案
        2.2.15 统计学分析
3 实验结果
    3.1 CHEPS有效抑制了NSCLC细胞的生长
        3.1.1 CHEPS对细胞形态的影响
        3.1.2 CHEPS对细胞活性的影响
    3.2 CHEPS能够通过调控细胞周期蛋白的表达诱导NSCLC细胞S和G2/M期停留
        3.2.1 CHEPS诱导了NSCLC细胞S和G2/M期停
        3.2.2 CHEPS能够调控细胞周期相关基因的表达
    3.3 CHEPS不能诱导细胞凋亡
        3.3.1 CHEPS不能诱导磷脂酰丝氨酸外翻
        3.3.2 CHEPS不能调控细胞凋亡相关蛋白的表达和剪切
    3.4 CHEPS诱导了细胞自噬的发生
        3.4.1 CHEPS能够诱导EGFP-LC3聚集
        3.4.2 CHEPS诱导了大量自噬溶酶体的生成
        3.4.3 细胞自噬的透射电镜观察
        3.4.4 CHEPS调控了自噬相关基因的表达
    3.5 CHEPS诱导了自噬潮的发生
        3.5.1 CHEPS能够诱导细胞自噬的起始和组装
        3.5.2 CHEPS能够诱导自噬小体和溶酶体的融合
        3.5.3 CHEPS能够诱导自噬溶酶体中自噬底物的降解
    3.6 CHEPS能够诱导NSCLC细胞自噬性死亡
    3.7 CHEPS不通过PI3K/AKT途径抑制细胞活性
    3.8 CHEPS不通过AMPK途径抑制细胞活性
        3.8.1 CHEPS激活了AMPK信号通路
        3.8.2 AMPK不能调控CHEPS诱导的细胞自噬和死亡
    3.9 CHEPS通过p38和ERK信号通路诱导细胞死亡
        3.9.1 CHEPS激活了p38、ERK和JNK信号通路
        3.9.2 p38和ERK促进了CHEPS诱导的细胞死亡
    3.10 p38和ERK调控了CHEPS诱导的细胞周期停留和自噬
        3.10.1 ERK促进了CHEPS诱导的S和G2/M期停留
        3.10.2 p38和ERK促进了CHEPS诱导的细胞自噬
    3.11 CHEPS通过ROS信号诱导细胞死亡
        3.11.1 CHEPS诱导了NSCLC细胞内ROS的产生
        3.11.2 ROS的产生促进了CHEPS诱导的NSCLC细胞死亡
    3.12 ROS通过p38/ERK介导的细胞自噬促进CHEPS诱导的NSCLC细胞死亡
        3.12.1 ROS不是通过细胞周期停留途径抑制CHEPS相关细胞生长
        3.12.2 ROS通过细胞自噬途径诱导CHEPS相关细胞死亡
        3.12.3 ROS促进了CHEPS诱导的p38和ERK磷酸化
    3.13 CHEPS在动物体内通过ROS介导的p38/ERK信号通路诱导NSCLC细胞自噬性细胞死亡
        3.13.1 CHEPS抑制了NSCLC细胞移植瘤在动物体内的生长
        3.13.2 CHEPS对裸鼠体重和器官没有明显毒副作用
        3.13.3 CHEPS能够诱导动物体内肺癌细胞移植瘤细胞自噬
        3.13.4 CHEPS诱导动物体内肺癌细胞移植瘤中p38和ERK的磷酸化及ROS的产生
    3.14 CHEPS诱导NSCLC细胞死亡模式图
4 讨论
参考文献
缩略词
博士研究生期间已发表或待发表的科研论文
致谢



本文编号：3837532