源于嗜热链球菌的真核CRISPR/Cas9系统的建立、优化及其应用研究

发布时间：2024-02-24 03:36

　　基因组靶向修饰技术对基因功能研究、基因治疗以及转基因育种研究等都具有重要的意义和价值,其中,特异性核酸内切酶的开发是基因组靶向修饰研究中的关键。锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)的发展为基因组靶向修饰研究提供了有效的技术手段。但是,特异性高效ZFNs的复杂筛选和TALENs的繁琐组装过程依旧是一个重大的技术挑战,并严重制约着动物基因编辑育种研究等相关领域的发展速度;因此,亟待开发一种经济高效、简单快捷、能够应用于哺乳动物的特异性核酸内切酶技术。2012年,源于酿脓链球菌的II型CRISPR/Cas免疫系统被首次在体外研究中应用于DNA分子的靶向切割,引发了业界的广泛关注。而早在2011年,嗜热链球菌的II型CRISPR/Cas系统CRISPR3就已经被证明能在大肠杆菌中特异性的切割外源质粒DNA。本研究在这种背景下展开,我们希望以嗜热链球菌CRISPR3系统为基础,开发一种新型的核酸酶技术,为以后进一步的基因组靶向修饰和动物基因编辑育种研究奠定基础。本研究中我们首先成功克隆得到了嗜热链球菌的Cas9基因并成功实现了其在酵母中的表达。然后我们相继建立了酵母...

【文章页数】：128 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1.1 基因组靶向修饰
    1.2 FokI介导的核酸酶技术
        1.2.1 锌指核酸酶技术
        1.2.2 TALE核酸酶技术
    1.3 CRISPR/Cas9核酸酶技术
        1.3.1 细菌CRISPR/Cas免疫系统
        1.3.2 CRISPR/Cas9核酸酶技术的体外研究
        1.3.3 CRISPR/Cas9核酸酶技术的迅速崛起
        1.3.4 CRISPR/Cas9核酸酶技术的优缺点
        1.3.5 CRISPR/Cas9衍生技术的开发
        1.3.6 不同来源的CRISPR/Cas平台开发
    1.4 本研究的目的意义
第二章 酵母StCRISPR/Cas9系统的建立
    2.1 试验材料
        2.1.1 菌种与培养基
        2.1.2 主要试剂和仪器
        2.1.3 引物序列
    2.2 试验方法
        2.2.1 bStCas9基因克隆和酵母表达载体构建
        2.2.2 StCas9蛋白在酵母中的表达检测
        2.2.3 导向RNA酵母表达载体构建
        2.2.4 导向RNA分子的设计
        2.2.5 基于Gal4的酵母报告载体构建
        2.2.6 Gal4报告载体自修复效率检测试验
        2.2.7 StCRISPR/Cas9系统活性验证酵母转化试验
        2.2.8 Gal4报告基因的修复检测
    2.3 试验结果
        2.3.1 bStCas9基因的克隆及表达
        2.3.2 Gal4报告载体自修复效率检测结果
        2.3.3 StCRISPR/Cas9系统在酵母中的活性验证
        2.3.4 Gal4报告基因的修复检测
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
第三章 酵母中StCRISPR/Cas9系统的优化
    3.1 材料与方法
        3.1.1 试验材料
        3.1.2 酵母转化试验
        3.1.3 sgRNA不同结构域的优化
        3.1.4 StCRISPR/Cas9脱靶效应研究
        3.1.5 StCRISPR/Cas9靶序列偏好性研究
        3.1.6 PAM序列的研究
        3.1.7 sgRNA的优化设计和功能验证
        3.1.8 StCas9密码子优化和功能验证
    3.2 试验结果
        3.2.1 sgRNA不同结构域的优化结果
        3.2.2 StCRISPR/Cas9脱靶效应研究结果
        3.2.3 StCRISPR/Cas9靶序列偏好性研究结果
        3.2.4 PAM序列的研究结果
        3.2.5 优化后sgRNA的功能验证
    3.3 讨论
    3.4 本章小结
第四章 StCRISPR/Cas9系统酵母基因组打靶验证
    4.1 材料与方法
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 整合型Gal4报告载体构建
        4.1.3 酵母报告菌株构建
        4.1.4 酵母报告菌株转化试验
        4.1.5 基因组中Gal4基因的修复检测
    4.2 试验结果
        4.2.1 酵母报告菌株的构建和鉴定
        4.2.2 不同SSA同源臂长度的报告菌株比较
        4.2.3 基因组中Gal4基因修复的检测结果
        4.2.4 StCRISPR/Cas9酵母基因组水平的打靶验证
    4.3 讨论
    4.4 本章小结
第五章 哺乳动物StCRISPR/Cas9系统的建立
    5.1 试验材料
        5.1.1 细胞系与培养基
        5.1.2 主要试剂和仪器
        5.1.3 引物序列
    5.2 试验方法
        5.2.1 StCas9哺乳动物表达载体构建
        5.2.2 不同策略的导向RNA表达载体构建
        5.2.3 SSA介导的eGFP报告载体构建
        5.2.4 细胞转染试验
        5.2.5 流式细胞术检测与分析
    5.3 试验结果
        5.3.1 哺乳动物StCRISPR/Cas9活性验证系统的建立
        5.3.2 不同导向RNA表达策略的比较
        5.3.3 优化后sgRNA.Opti在HEK293中的活性验证
        5.3.4 StCRISPR/Cas9对鼠ROSA26靶序列的打靶验证
    5.4 讨论
    5.5 本章小结
第六章 StCRISPR/Cas9系统HEK293T细胞基因组打靶研究
    6.1 材料与方法
        6.1.1 试验材料
        6.1.2 整合型eGFP报告载体构建
        6.1.3 HEK293T报告细胞系构建
        6.1.4 HEK293T报告细胞系转染试验
        6.1.5 报告细胞系中的基因组打靶检测
        6.1.6 HEK293T内源基因打靶载体构建及活性验证
        6.1.7 RPG双报告基因载体构建
        6.1.8 HEK293T内源基因打靶及突变检测
    6.2 试验结果
        6.2.1 HEK293报告细胞系基因组打靶验证结果
        6.2.2 HEK293T内源基因打靶载体活性验证结果
        6.2.3 核酸酶阳性细胞的RPG富集
        6.2.4 HEK293T内源基因的突变检测结果
    6.3 讨论
    6.4 本章小结
结论与创新点
参考文献
附录
缩略 词
致谢
作者简介



本文编号：3908459