鉴定增强寨卡病毒神经毒性因素的研究
发布时间：2023-11-04 11:12
2015-2016年,寨卡病毒在全球范围内大规模爆发流行,暴露出该病毒感染与特定神经系统疾病的发生率增加有关,比如先天性寨卡综合征(含小头症)和成人格林-巴利综合征。然而,造成寨卡病毒神经感染性增强的因素仍然不确定。我们假设,寨卡病毒在感染神经系统时,部分病毒基因组发生适应性突变,可能增强了病毒对神经系统的感染性。由于寨卡病毒可以感染野生型新生小鼠,并可导致类似小头症、瘫痪和癫痫发作的神经性疾病;而这些神经系统表现与新生小鼠神经元祖细胞和其他神经细胞的寨卡感染有关,所以,我们认为新生乳鼠可以作为研究寨卡病毒遗传特征如何对中枢神经系统发病机制产生影响的实验模型。为了验证假设,我们在新生乳鼠大脑中将寨卡病毒2016年临床分离株SW01连续传播11代,获得了适应小鼠中枢神经系统(CNS)的寨卡病毒MA-SW01,并发现该病毒在体内的神经毒性和复制能力显著增强,且主要靶向区域为大脑皮层和海马区。通过高通量测序,我们发现MA-SW01全基因组上有4个大于80%的高频错义突变,这些突变导致3个E蛋白氨基酸突变(D67N,M68I,N154D)和1个NS2A蛋白氨基酸突变(A117T)。进一步病毒反...
【文章页数】：105 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
第一章 引言
1.1 寨卡病毒概述
1.1.1 寨卡病毒的传播途径和流行病学
1.1.2 寨卡病毒的基因组与分类
1.1.3 寨卡病毒的结构
1.1.4 寨卡病毒的生命周期
1.1.5 寨卡病毒感染后的临床症状
1.2 寨卡病毒基因突变与其感染性的关系
1.3 寨卡病毒神经毒性的研究
1.3.1 PrM蛋白进化突变论
1.3.2 E蛋白糖基化修饰论
1.3.3 非结构蛋白作用论
1.3.4 ADE效应论
1.4 利用小鼠进行寨卡病毒适应性进化研究的可行性
1.5 寨卡病毒反向遗传学研究
1.6 研究寨卡病毒病理学的小鼠模型
1.6.1 免疫缺陷成年小鼠模型
1.6.2 免疫健全成年小鼠模型
1.6.3 胎鼠和新生乳鼠模型
第二章 实验材料和方法
2.1 实验仪器
2.2 实验试剂和材料
2.3 实验方法
2.3.1 寨卡病毒的体外扩增繁殖
2.3.2 寨卡病毒在乳鼠颅内的生长曲线的测定
2.3.3 寨卡病毒在乳鼠体内的接种传代
2.3.4 寨卡病毒滴度的测定
2.3.5 寨卡病毒小鼠毒力测试
2.3.6 组织器官RNA提取方法
2.3.7 组织器官中病毒载量的测定
2.3.7.1 cDNA合成
2.3.7.2 实时定量PCR(qPCR)
2.3.8 免疫荧光检测脑组织病毒感染
2.3.9 寨卡病毒高通量测序与分析
2.3.10 单克隆病毒的挑选与扩增
2.3.11 单克隆病毒E蛋白核酸序列的测定
2.3.12 反向遗传学构建定点突变寨卡病毒
2.3.13 免疫荧光检测细胞感染
2.3.14 病毒遗传稳定性体外检测
2.3.15 寨卡病毒和登革热病毒E蛋白序列的多重比较
2.3.16 寨卡病毒糖基化检测
2.3.17 流式细胞技术定量感染细胞
2.3.18 统计分析方法
2.4 伦理声明
第三章 实验结果
3.1 建立寨卡病毒感染乳鼠中枢神经系统的病毒传代模型
3.2 小鼠CNS适应性寨卡病毒MA-SW01 展现出病毒毒力增强特征
3.3 MA-SW01 可以在乳鼠大脑中建立复制优势
3.4 MA-SW01 的主要靶向区域是大脑的海马区和皮层区
3.5 从MA-SW01 病毒株分离出的单克隆病毒即具有毒力增强的表型
3.6 高通量测序发现MA-SW01 产生4 个高频错义突变
3.7 构建含E蛋白突变和NS2A突变的感染性克隆病毒
3.8 E蛋白67-68 位的连续突变对病毒毒力增强至关重要
3.9 测序分析显示E蛋白67 位点是潜在的毒力决定位点
3.10 E蛋白67 位点是病毒毒力增强决定位点
3.11 E蛋白68 位点突变对维持病毒67 位点突变稳定性不是必要条件
3.12 E蛋白67 位点突变没有形成经典的糖基化功能
3.13 E蛋白67 位点突变增强了病毒在乳鼠大脑中的复制能力
3.14 E蛋白67 位点的替代突变可能是病毒在CNS的适应性结果
第四章 总结与讨论
4.1 课题结论与潜在意义
4.2 课题设计的不足之处
4.3 课题研究的重点展望
参考文献
略缩语
作者简历
代表性文章
专业综述
References
致谢
本文编号：3860189
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【学位级别】：博士
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中文摘要
英文摘要
第一章 引言
1.1 寨卡病毒概述
1.1.1 寨卡病毒的传播途径和流行病学
1.1.2 寨卡病毒的基因组与分类
1.1.3 寨卡病毒的结构
1.1.4 寨卡病毒的生命周期
1.1.5 寨卡病毒感染后的临床症状
1.2 寨卡病毒基因突变与其感染性的关系
1.3 寨卡病毒神经毒性的研究
1.3.1 PrM蛋白进化突变论
1.3.2 E蛋白糖基化修饰论
1.3.3 非结构蛋白作用论
1.3.4 ADE效应论
1.4 利用小鼠进行寨卡病毒适应性进化研究的可行性
1.5 寨卡病毒反向遗传学研究
1.6 研究寨卡病毒病理学的小鼠模型
1.6.1 免疫缺陷成年小鼠模型
1.6.2 免疫健全成年小鼠模型
1.6.3 胎鼠和新生乳鼠模型
第二章 实验材料和方法
2.1 实验仪器
2.2 实验试剂和材料
2.3 实验方法
2.3.1 寨卡病毒的体外扩增繁殖
2.3.2 寨卡病毒在乳鼠颅内的生长曲线的测定
2.3.3 寨卡病毒在乳鼠体内的接种传代
2.3.4 寨卡病毒滴度的测定
2.3.5 寨卡病毒小鼠毒力测试
2.3.6 组织器官RNA提取方法
2.3.7 组织器官中病毒载量的测定
2.3.7.1 cDNA合成
2.3.7.2 实时定量PCR(qPCR)
2.3.8 免疫荧光检测脑组织病毒感染
2.3.9 寨卡病毒高通量测序与分析
2.3.10 单克隆病毒的挑选与扩增
2.3.11 单克隆病毒E蛋白核酸序列的测定
2.3.12 反向遗传学构建定点突变寨卡病毒
2.3.13 免疫荧光检测细胞感染
2.3.14 病毒遗传稳定性体外检测
2.3.15 寨卡病毒和登革热病毒E蛋白序列的多重比较
2.3.16 寨卡病毒糖基化检测
2.3.17 流式细胞技术定量感染细胞
2.3.18 统计分析方法
2.4 伦理声明
第三章 实验结果
3.1 建立寨卡病毒感染乳鼠中枢神经系统的病毒传代模型
3.2 小鼠CNS适应性寨卡病毒MA-SW01 展现出病毒毒力增强特征
3.3 MA-SW01 可以在乳鼠大脑中建立复制优势
3.4 MA-SW01 的主要靶向区域是大脑的海马区和皮层区
3.5 从MA-SW01 病毒株分离出的单克隆病毒即具有毒力增强的表型
3.6 高通量测序发现MA-SW01 产生4 个高频错义突变
3.7 构建含E蛋白突变和NS2A突变的感染性克隆病毒
3.8 E蛋白67-68 位的连续突变对病毒毒力增强至关重要
3.9 测序分析显示E蛋白67 位点是潜在的毒力决定位点
3.10 E蛋白67 位点是病毒毒力增强决定位点
3.11 E蛋白68 位点突变对维持病毒67 位点突变稳定性不是必要条件
3.12 E蛋白67 位点突变没有形成经典的糖基化功能
3.13 E蛋白67 位点突变增强了病毒在乳鼠大脑中的复制能力
3.14 E蛋白67 位点的替代突变可能是病毒在CNS的适应性结果
第四章 总结与讨论
4.1 课题结论与潜在意义
4.2 课题设计的不足之处
4.3 课题研究的重点展望
参考文献
略缩语
作者简历
代表性文章
专业综述
References
致谢
本文编号：3860189
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