甲酰甘氨酸生成酶催化纳米抗体的定点醛基化修饰及其应用
发布时间：2023-05-14 02:05
纳米抗体,也称为单域抗体或重链抗体可变区,是一种分子量只有常规抗体十分之一大小,但仍具备较好抗原结合能力的抗体分子。因其具有结构尺度小、生化性质稳定、易于原核表达等特点,在各类研究及应用中引起了广泛关注。为进一步拓展其应用,纳米抗体的修饰和固定化等改造至关重要。传统化学修饰方法容易使纳米抗体结构受到影响甚至失去活性,所以须采用更为可控的定点修饰技术进行改造。但现有技术存在效率较低或步骤复杂等缺陷,因此,迫切需要发展一种简便高效的定点修饰技术以满足纳米抗体的应用需求。目前,由于融合标签小,操作简便等优点,甲酰甘氨酸生成酶(Formylglycine-generating enzyme,FGE)催化的蛋白质定点醛基化修饰方法正在受到越来越多的关注。基于纳米抗体的抗原结合域临近N端,本文提出利用FGE催化对纳米抗体的C端进行定点醛基化修饰,并探索了其在一步定点固定化、构建C端-C端(C-C)连接二价抗体和以纳米抗体为单体制备功能化冰胶整体材料方面的应用,具体开展了以下四个方面的工作:(1)首先尝试了在大肠杆菌胞内共表达FGE以催化纳米抗体定点醛基化修饰,但发现纳米抗体的可溶表达和催化不能同时...
【文章页数】：156 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要缩写词和符号表
1 绪论
1.1 蛋白质的修饰方法研究进展
1.1.1 经典化学修饰方法
1.1.2 定点化学修饰方法
1.1.3 酶法定点修饰方法
1.2 定点醛基化修饰研究进展
1.2.1 甲酰甘氨酸生成酶(Formylglycine-generating Enzyme,FGE)概述
1.2.2 定点醛基化修饰的应用
1.3 纳米抗体研究进展
1.3.1 纳米抗体概述
1.3.2 纳米抗体的应用
1.4 本文主要研究思路和内容
2 甲酰甘氨酸生成酶胞内催化目标蛋白定点醛基化修饰用于无纯化固定化
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 实验材料和仪器
2.2.2 融合Ald-tag的蛋白A重组表达载体的构建
2.2.3 共表达Ald-tag蛋白A和FGE的菌株构建
2.2.4 胞内共表达FGE催化蛋白A醛基化修饰
2.2.5 表面酰肼功能化琼脂糖微球的制备
2.2.6 蛋白浓度测定
2.2.7 从细胞破碎上清液中一步固定化蛋白A的步骤
2.2.8 醛基蛋白A填料对血清中IgG动态吸附的评价
2.2.9 醛基蛋白A填料的稳定性测试
2.3 结果与讨论
2.3.1 蛋白A的体内定点醛基化修饰
2.3.2 从细胞破碎上清液中一步固定化蛋白A的评价
2.3.3 不同细胞破碎上清液处理方式对固定化的影响
2.3.4 醛基蛋白A填料对血清中IgG的动态吸附评价
2.3.5 醛基蛋白A填料的稳定性评价
2.4 本章小结
3 甲酰甘氨酸生成酶体外催化纳米抗体高效定点醛基化修饰
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验材料和仪器
3.2.2 FGE的表达与纯化
3.2.3 FGE体外催化纳米抗体定点醛基化修饰与表征
3.2.4 FGE体外催化条件优化过程
3.2.5 FGE肽指纹图谱获得与分析
3.2.6 FGE及其突变体表征
3.2.7 蛋白浓度测定
3.3 结果与讨论
3.3.1 FGE的表达与纯化
3.3.2 FGE体外催化纳米抗体定点醛基化修饰
3.3.3 优化的FGE体外催化条件
3.3.4 FGE自体醛基化修饰现象的验证
3.3.5 FGE-C238A和-C239A突变体的表征
3.4 本章小结
4 冷冻辅助合成C端-C端连接的二价及双特异性纳米抗体
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验材料和仪器
4.2.2 纳米抗体及C-N连接二价纳米抗体的表达与纯化
4.2.3 纳米抗体体外定点醛基化修饰
4.2.4 双氧氨基接头的合成
4.2.5 高效液相法检测二价纳米抗体的生成
4.2.6 冷冻条件下制备C-C连接的二价及双特异性纳米抗体
4.2.7 透射电镜观察二价纳米抗体复合物
4.2.8 表面等离子体共振表征纳米抗体及复合物的亲和力
4.3 结果与讨论
4.3.1 纳米抗体的表达纯化
4.3.2 纳米抗体的体外醛基化修饰
4.3.3 冷冻条件下的二价纳米抗体合成
4.3.4 冷冻提高反应速率的机理初探
4.3.5 冷冻条件下合成双特异性纳米抗体
4.3.6 纳米抗体及其C-C,C-N连接复合物的亲和力表征与对比
4.4 本章小结
5 以纳米抗体为单体原位聚合一锅法制备多孔冰胶整体材料
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.0 实验材料和仪器
5.2.1 醛基化修饰的纳米抗体连接含氨基化合物的方法与表征
5.2.2 以纳米抗体为单体原位聚合制备冰胶
5.2.3 冰胶的表征
5.2.4 原位聚合NB1冰胶对hβ2M的等温吸附曲线测定
5.2.5 冰胶对复杂体系中hβ2M的动态吸附表征
5.2.6 冰胶的保存稳定性表征
5.2.7 蛋白浓度测定
5.3 结果与讨论
5.3.1 醛基化修饰的纳米抗体进一步连接含氨基化合物
5.3.2 以纳米抗体为单体与不同单体交联剂体系共聚
5.3.3 AAm-NB 1-PEGDA冰胶的结构表征
5.3.4 AAm-NB1-PEGDA冰胶对hβ2M的吸附
5.3.5 AAm-NB1-PEGDA冰胶对细胞破碎上清中hβ2M的动态吸附
5.3.6 AAm-NB1-PEGDA冰胶的保存稳定性
5.4 本章小结
6 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
附录A FGE、蛋白A及纳米抗体氨基酸序列
附录B 纳米抗体及其多种复合物的SPR结合-解离曲线
附录C 纳米抗体NB1多种分子修饰质谱鉴定
攻读博士学位期间获得的科研成果及参与的科研项目
致谢
作者简介
本文编号：3816967
【文章页数】：156 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要缩写词和符号表
1 绪论
1.1 蛋白质的修饰方法研究进展
1.1.1 经典化学修饰方法
1.1.2 定点化学修饰方法
1.1.3 酶法定点修饰方法
1.2 定点醛基化修饰研究进展
1.2.1 甲酰甘氨酸生成酶(Formylglycine-generating Enzyme,FGE)概述
1.2.2 定点醛基化修饰的应用
1.3 纳米抗体研究进展
1.3.1 纳米抗体概述
1.3.2 纳米抗体的应用
1.4 本文主要研究思路和内容
2 甲酰甘氨酸生成酶胞内催化目标蛋白定点醛基化修饰用于无纯化固定化
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 实验材料和仪器
2.2.2 融合Ald-tag的蛋白A重组表达载体的构建
2.2.3 共表达Ald-tag蛋白A和FGE的菌株构建
2.2.4 胞内共表达FGE催化蛋白A醛基化修饰
2.2.5 表面酰肼功能化琼脂糖微球的制备
2.2.6 蛋白浓度测定
2.2.7 从细胞破碎上清液中一步固定化蛋白A的步骤
2.2.8 醛基蛋白A填料对血清中IgG动态吸附的评价
2.2.9 醛基蛋白A填料的稳定性测试
2.3 结果与讨论
2.3.1 蛋白A的体内定点醛基化修饰
2.3.2 从细胞破碎上清液中一步固定化蛋白A的评价
2.3.3 不同细胞破碎上清液处理方式对固定化的影响
2.3.4 醛基蛋白A填料对血清中IgG的动态吸附评价
2.3.5 醛基蛋白A填料的稳定性评价
2.4 本章小结
3 甲酰甘氨酸生成酶体外催化纳米抗体高效定点醛基化修饰
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 实验材料和仪器
3.2.2 FGE的表达与纯化
3.2.3 FGE体外催化纳米抗体定点醛基化修饰与表征
3.2.4 FGE体外催化条件优化过程
3.2.5 FGE肽指纹图谱获得与分析
3.2.6 FGE及其突变体表征
3.2.7 蛋白浓度测定
3.3 结果与讨论
3.3.1 FGE的表达与纯化
3.3.2 FGE体外催化纳米抗体定点醛基化修饰
3.3.3 优化的FGE体外催化条件
3.3.4 FGE自体醛基化修饰现象的验证
3.3.5 FGE-C238A和-C239A突变体的表征
3.4 本章小结
4 冷冻辅助合成C端-C端连接的二价及双特异性纳米抗体
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 实验材料和仪器
4.2.2 纳米抗体及C-N连接二价纳米抗体的表达与纯化
4.2.3 纳米抗体体外定点醛基化修饰
4.2.4 双氧氨基接头的合成
4.2.5 高效液相法检测二价纳米抗体的生成
4.2.6 冷冻条件下制备C-C连接的二价及双特异性纳米抗体
4.2.7 透射电镜观察二价纳米抗体复合物
4.2.8 表面等离子体共振表征纳米抗体及复合物的亲和力
4.3 结果与讨论
4.3.1 纳米抗体的表达纯化
4.3.2 纳米抗体的体外醛基化修饰
4.3.3 冷冻条件下的二价纳米抗体合成
4.3.4 冷冻提高反应速率的机理初探
4.3.5 冷冻条件下合成双特异性纳米抗体
4.3.6 纳米抗体及其C-C,C-N连接复合物的亲和力表征与对比
4.4 本章小结
5 以纳米抗体为单体原位聚合一锅法制备多孔冰胶整体材料
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.0 实验材料和仪器
5.2.1 醛基化修饰的纳米抗体连接含氨基化合物的方法与表征
5.2.2 以纳米抗体为单体原位聚合制备冰胶
5.2.3 冰胶的表征
5.2.4 原位聚合NB1冰胶对hβ2M的等温吸附曲线测定
5.2.5 冰胶对复杂体系中hβ2M的动态吸附表征
5.2.6 冰胶的保存稳定性表征
5.2.7 蛋白浓度测定
5.3 结果与讨论
5.3.1 醛基化修饰的纳米抗体进一步连接含氨基化合物
5.3.2 以纳米抗体为单体与不同单体交联剂体系共聚
5.3.3 AAm-NB 1-PEGDA冰胶的结构表征
5.3.4 AAm-NB1-PEGDA冰胶对hβ2M的吸附
5.3.5 AAm-NB1-PEGDA冰胶对细胞破碎上清中hβ2M的动态吸附
5.3.6 AAm-NB1-PEGDA冰胶的保存稳定性
5.4 本章小结
6 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
附录A FGE、蛋白A及纳米抗体氨基酸序列
附录B 纳米抗体及其多种复合物的SPR结合-解离曲线
附录C 纳米抗体NB1多种分子修饰质谱鉴定
攻读博士学位期间获得的科研成果及参与的科研项目
致谢
作者简介
本文编号：3816967
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