立体选择性酰胺酶的筛
发布时间：2023-01-12 13:33
酰胺酶即酰胺水解酶,是一种能断裂非肽键型酰胺键的一种水解酶。酰胺酶具有较高的催化活性、严格的立体选择性和广泛的底物谱等特性,使得越来越多的研究集中于酰胺酶在手性农药、手性药物和手性氨基酸的合成中。L-草铵膦（L-PPT）是在吸水链霉菌中发现的一种天然产生的L型的含磷氨基酸,同时也是一种对环境无害的广谱型、触杀型、灭生性除草剂,具有重要的应用前景。与传统的化学法合成草铵膦相比,通过酰胺酶催化合成L-草铵膦的方法具有立体选择性好、反应条件温和、转化率高、后续分离纯化操作简便、环境友好等优势。本文通过产酶微生物菌株的筛选和酰胺酶基因挖掘等手段获得了具有较高活力的立体选择性的酰胺酶,并将其在枯草芽孢杆菌中实现了分泌表达,研究了其酶学性质,并通过定向进化的方法对其酰胺酶活力进行了改造,应用于L-草铵膦的合成中。主要研究内容如下:（1）立体选择性酰胺酶酶库的构建。建立了一个快速、高效、灵敏的高通量筛选方法用于催化生产草铵膦的相关产酶微生物及生物酶的筛选,运用此方法从土壤中筛选到了十株产酰胺酶的新菌株,其中有两株菌株具有产高活力、高立体选择性酰胺酶的能力:Kluyvera cryocrescens ...
【文章页数】：188 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 手性氨基酸概述
1.1.1 手性氨基酸
1.1.2 手性氨基酸的制备方法
1.2 草铵膦概述
1.2.1 草铵膦的生化功能
1.2.2 DL-草铵膦的化学合成法
1.2.3 L-草铵膦的化学合成
1.2.4 L-草铵膦的生物合成
1.3 酰胺酶
1.3.1 酰胺酶简介与分类
1.3.2 酰胺酶的底物特异性与立体选择性
1.3.3 酰胺酶的筛选
1.3.4 酰胺酶的克隆表达
1.3.5 酰胺酶的分子改造
1.4 枯草芽孢杆菌表达系统
1.4.1 枯草芽孢杆菌
1.4.2 影响枯草芽孢杆菌表达因素简介
1.4.3 启动子
1.4.4 信号肽
1.5 课题研究意义和主要研究内容
1.5.1 课题立项依据和研究意义
1.5.2 研究内容
第二章 立体选择性酰胺酶的筛选
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 主要实验试剂
2.2.2 菌种质粒及培养基
2.2.3 实验仪器与设备
2.2.4 高通量筛选方法的建立
2.2.5 立体选择性酰胺酶产生菌的筛选
2.2.6 产酶微生物菌株的鉴定
2.2.7 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备与质粒的转化
2.2.8 立体选择性酰胺酶基因的挖掘
2.2.9 重组质粒构建
2.2.10 酰胺酶全基因合成
2.2.11 重组酰胺酶的表达与酰胺酶粗酶制备
2.2.12 核酸与蛋白电泳
2.2.13 酰胺酶催化底物转化成L-PPT的转化率与e.e.值测定
2.2.14 L-草铵膦的含量与e.e.值分析
2.3 结果与讨论
2.3.1 高通量筛选方法的建立与验证
2.3.2 酰胺酶产生菌的筛选与鉴定
2.3.3 酰胺酶基因的挖掘
2.3.4 产酰胺酶菌株中酰胺酶基因的克隆
2.3.5 重组酰胺酶基因的分泌表达
2.4 本章小结
第三章 酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 主要实验试剂
3.2.2 菌株试剂及培养基
3.2.3 实验仪器及设备
3.2.4 枯草芽孢杆菌基因组提取
3.2.5 枯草芽孢杆菌内源启动子与信号肽引物设计
3.2.6 含有不同启动子质粒的构建
3.2.7 单启动子的筛选与表征
3.2.8 双启动子构建
3.2.9 具备高效分泌效率的信号肽的筛选
3.2.10 枯草芽孢杆菌的扩大培养
3.2.11 酰胺酶文库中酰胺酶的分泌表达
3.3 结果与分析
3.3.1 枯草芽孢杆菌内源启动子的筛选与表征
3.3.2 Bm-Ami在枯草芽孢杆菌内源性启动子作用下的活力测定与表征
3.3.3 Bm-Ami在枯草芽孢杆菌串联双启动子作用下的活力测定与表征
3.3.4 信号肽的筛选
3.3.5 Bm-Ami在5 L发酵罐中的扩大生产
3.3.6 酰胺酶文库中酰胺酶的分泌表达
3.4 本章小结
第四章 立体选择性酰胺酶的酶学性质分析
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 主要实验试剂
4.2.2 菌种质粒及培养基
4.2.3 实验仪器与设备
4.2.4 立体选择性酰胺酶表达及纯化
4.2.5 重组酰胺酶酶活测定与蛋白含量测定
4.2.6 重组酰胺酶酶学性质的测定
4.2.7 酰胺酶动力学参数的测定
4.2.8 底物特异性
4.3 结果与分析
4.3.1 重组立体选择性酰胺酶的序列结构分析
4.3.2 重组立体选择性酰胺酶的系统发育分析
4.3.3 重组立体选择性酰胺酶的纯化
4.3.4 pH对酰胺酶酶活的影响及pH稳定性
4.3.5 温度对酰胺酶酶活的影响及温度稳定性
4.3.6 金属离子、特殊化学物质和有机溶剂对酶活的影响
4.3.7 动力学参数的测定
4.3.8 底物特异性
4.4 本章小结
第五章 重组酰胺酶的分子改造
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 主要实验试剂
5.2.2 菌株、质粒及培养基
5.2.3 实验仪器与设备
5.2.4 酰胺酶Bm-Ami的同源建模
5.2.5 酰胺酶模型YBm-Ami的活性口袋预测及分析
5.2.6 酰胺酶突变文库的构建与筛选
5.2.7 酰胺酶突变体动力学参数的测定
5.2.8 酰胺酶突变体的分子对接分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 酰胺酶同源建模及活性口袋预测及分析
5.3.2 酰胺酶突变文库的建立及筛选
5.3.3 组合突变和最优突变株的确立
5.3.4 动力学参数测定
5.3.5 酰胺酶突变体的分子对接分析
5.4 本章小结
第六章 立体选择性酰胺酶在L-草铵膦合成中的应用
6.1 引言
6.2 材料与方法
6.2.1 主要实验试剂
6.2.2 菌株、质粒及培养基
6.2.3 实验仪器及设备
6.2.4 生物催化剂的制备
6.2.5 底物rac-4-[羟基(甲基)膦酰基]-2-(2-苯乙酰基)-丁酸(rac-S)的合成
6.2.6 立体选择性酰胺酶催化底物合成L-草铵膦的条件研究
6.2.7 不同底物浓度的反应进程研究
6.2.8 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦
6.2.9 L-草铵膦的分离纯化
6.3 结果与讨论
6.3.1 Rac-S的合成
6.3.2 酰胺酶的制备
6.3.3 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦的条件优化
6.3.4 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦的反应进程研究
6.3.5 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦
6.3.6 L-草铵膦的分离纯化及D型底物的消旋化
6.3.7 L-草铵膦的表征
6.4 本章小结
第七章 结论与展望
7.1 结论
7.2 主要贡献与创新
7.3 展望
参考文献
附录
致谢
作者简介
1 作者简历
2 攻读博士学位期间发表的学术论文
3 参与的科研项目情况
4 发明专利
学位论文数据集
本文编号：3729994
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【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 手性氨基酸概述
1.1.1 手性氨基酸
1.1.2 手性氨基酸的制备方法
1.2 草铵膦概述
1.2.1 草铵膦的生化功能
1.2.2 DL-草铵膦的化学合成法
1.2.3 L-草铵膦的化学合成
1.2.4 L-草铵膦的生物合成
1.3 酰胺酶
1.3.1 酰胺酶简介与分类
1.3.2 酰胺酶的底物特异性与立体选择性
1.3.3 酰胺酶的筛选
1.3.4 酰胺酶的克隆表达
1.3.5 酰胺酶的分子改造
1.4 枯草芽孢杆菌表达系统
1.4.1 枯草芽孢杆菌
1.4.2 影响枯草芽孢杆菌表达因素简介
1.4.3 启动子
1.4.4 信号肽
1.5 课题研究意义和主要研究内容
1.5.1 课题立项依据和研究意义
1.5.2 研究内容
第二章 立体选择性酰胺酶的筛选
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 主要实验试剂
2.2.2 菌种质粒及培养基
2.2.3 实验仪器与设备
2.2.4 高通量筛选方法的建立
2.2.5 立体选择性酰胺酶产生菌的筛选
2.2.6 产酶微生物菌株的鉴定
2.2.7 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备与质粒的转化
2.2.8 立体选择性酰胺酶基因的挖掘
2.2.9 重组质粒构建
2.2.10 酰胺酶全基因合成
2.2.11 重组酰胺酶的表达与酰胺酶粗酶制备
2.2.12 核酸与蛋白电泳
2.2.13 酰胺酶催化底物转化成L-PPT的转化率与e.e.值测定
2.2.14 L-草铵膦的含量与e.e.值分析
2.3 结果与讨论
2.3.1 高通量筛选方法的建立与验证
2.3.2 酰胺酶产生菌的筛选与鉴定
2.3.3 酰胺酶基因的挖掘
2.3.4 产酰胺酶菌株中酰胺酶基因的克隆
2.3.5 重组酰胺酶基因的分泌表达
2.4 本章小结
第三章 酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 主要实验试剂
3.2.2 菌株试剂及培养基
3.2.3 实验仪器及设备
3.2.4 枯草芽孢杆菌基因组提取
3.2.5 枯草芽孢杆菌内源启动子与信号肽引物设计
3.2.6 含有不同启动子质粒的构建
3.2.7 单启动子的筛选与表征
3.2.8 双启动子构建
3.2.9 具备高效分泌效率的信号肽的筛选
3.2.10 枯草芽孢杆菌的扩大培养
3.2.11 酰胺酶文库中酰胺酶的分泌表达
3.3 结果与分析
3.3.1 枯草芽孢杆菌内源启动子的筛选与表征
3.3.2 Bm-Ami在枯草芽孢杆菌内源性启动子作用下的活力测定与表征
3.3.3 Bm-Ami在枯草芽孢杆菌串联双启动子作用下的活力测定与表征
3.3.4 信号肽的筛选
3.3.5 Bm-Ami在5 L发酵罐中的扩大生产
3.3.6 酰胺酶文库中酰胺酶的分泌表达
3.4 本章小结
第四章 立体选择性酰胺酶的酶学性质分析
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 主要实验试剂
4.2.2 菌种质粒及培养基
4.2.3 实验仪器与设备
4.2.4 立体选择性酰胺酶表达及纯化
4.2.5 重组酰胺酶酶活测定与蛋白含量测定
4.2.6 重组酰胺酶酶学性质的测定
4.2.7 酰胺酶动力学参数的测定
4.2.8 底物特异性
4.3 结果与分析
4.3.1 重组立体选择性酰胺酶的序列结构分析
4.3.2 重组立体选择性酰胺酶的系统发育分析
4.3.3 重组立体选择性酰胺酶的纯化
4.3.4 pH对酰胺酶酶活的影响及pH稳定性
4.3.5 温度对酰胺酶酶活的影响及温度稳定性
4.3.6 金属离子、特殊化学物质和有机溶剂对酶活的影响
4.3.7 动力学参数的测定
4.3.8 底物特异性
4.4 本章小结
第五章 重组酰胺酶的分子改造
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 主要实验试剂
5.2.2 菌株、质粒及培养基
5.2.3 实验仪器与设备
5.2.4 酰胺酶Bm-Ami的同源建模
5.2.5 酰胺酶模型YBm-Ami的活性口袋预测及分析
5.2.6 酰胺酶突变文库的构建与筛选
5.2.7 酰胺酶突变体动力学参数的测定
5.2.8 酰胺酶突变体的分子对接分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 酰胺酶同源建模及活性口袋预测及分析
5.3.2 酰胺酶突变文库的建立及筛选
5.3.3 组合突变和最优突变株的确立
5.3.4 动力学参数测定
5.3.5 酰胺酶突变体的分子对接分析
5.4 本章小结
第六章 立体选择性酰胺酶在L-草铵膦合成中的应用
6.1 引言
6.2 材料与方法
6.2.1 主要实验试剂
6.2.2 菌株、质粒及培养基
6.2.3 实验仪器及设备
6.2.4 生物催化剂的制备
6.2.5 底物rac-4-[羟基(甲基)膦酰基]-2-(2-苯乙酰基)-丁酸(rac-S)的合成
6.2.6 立体选择性酰胺酶催化底物合成L-草铵膦的条件研究
6.2.7 不同底物浓度的反应进程研究
6.2.8 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦
6.2.9 L-草铵膦的分离纯化
6.3 结果与讨论
6.3.1 Rac-S的合成
6.3.2 酰胺酶的制备
6.3.3 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦的条件优化
6.3.4 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦的反应进程研究
6.3.5 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦
6.3.6 L-草铵膦的分离纯化及D型底物的消旋化
6.3.7 L-草铵膦的表征
6.4 本章小结
第七章 结论与展望
7.1 结论
7.2 主要贡献与创新
7.3 展望
参考文献
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1 作者简历
2 攻读博士学位期间发表的学术论文
3 参与的科研项目情况
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本文编号：3729994
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