除草剂乳氟禾草灵降解菌株的分离，新种鉴定及降解机理研究

发布时间：2024-03-06 01:52

　　乳氟禾草灵(lactofen)是由美国PPG工业公司开发的一种二苯醚类除草剂,主要应用于大豆、禾谷作物、马铃薯和花生田内防除阔叶杂草。随着该除草剂的大量使用,对于环境造成了不同程度的污染。有研究结果表明该除草剂对环境中的鱼类和水生无脊椎动物高毒,比如对虾的半致死浓度在0.02 mgL-1左右,对鱼的半致死浓度约0.46mgL-1,此外,高剂量的乳氟禾草灵对人体具有致癌性。乳氟禾草灵在环境中的残留动态过程与微生物的降解与转化密切相关,了解微生物在这一过程中的作用对于该除草剂残留的去除具有一定的理论和实践意义。目前,关于乳氟禾草灵所属的二苯醚类除草剂的微生物降解已有一些报道,但主要集中于降解菌株的分离、筛选以及中间代谢产物的鉴定方面,从降解基因及酶学水平上阐述二苯醚类除草剂微生物降解机制的报道则很少。本研究着力于分离、筛选乳氟禾草灵降解菌株,研究其降解特性及降解途径,克隆参与乳氟禾草灵降解的功能基因,研究其酶学特性,从基因和酶学水平上研究乳氟禾草灵的微生物降解机制。此外,还以分离所得的降解菌株为材料,研究投加降解菌株对玉米除草剂药害的解除作用。本研究通过富集培养的方法,从长期受除草剂污染的...

【文章页数】：145 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号与缩略语说明
前言
第一部分 文献综述
    1 二苯醚类除草剂简介
    2 二苯醚类除草剂的作用机制
    3 二苯醚类除草剂的毒性和环境危害
    4 二苯醚类除草剂的环境行为
    5 二苯醚类除草剂微生物降解的研究进展
    6 酯酶的研究简介
        6.1 酯酶结构特点及其催化机制
        6.2 酯酶的分类
    7 手性除草剂的选择性降解
    8 二苯醚类除草剂环境残留的生物修复研究
    9 二苯醚类除草剂微生物降解研究存在的问题及本研究的意义
    参考文献
第二部分 实验部分
    第一章 乳氟禾草灵降解菌株的分离、筛选和鉴定
        第一节 乳氟禾草灵降解菌株的分离筛选
            1 材料与方法
                1.1 培养基与菌株
                1.2 供试农药及化学试剂
                1.3 降解菌株的分离筛选
                1.4 降解菌株的16S rRNA基因序列分析
                1.5 降解菌株系统发育地位的确定
                1.6 乳氟禾草灵含量测定方法
            2 结果与分析
                2.1 乳氟禾草灵降解菌株的分离筛选
                2.2 降解菌株的菌落形态及生理生化特征
                2.3 降解菌株的系统发育树分析
        第二节 乳氟禾草灵降解菌株M-8的分类地位研究
            1 材料与方法
                1.1 菌株、培养基和试剂
                1.2 菌株基本生长特性
                1.3 API鉴定系统分析
                1.4 Biolog碳源利用分析
                1.5 其他生理生化特性
                1.6 细胞化学组成研究
                1.7 G+C mol%含量的测定
                1.8 DNA-DNA杂交分析
            2 结果与分析
                2.1 生理生化特性
                2.2 细胞化学组成研究
                2.3 G+C mol%含量测定
                2.4 DNA-DNA同源性分析
                2.5 Terrimonas属新种Terrimonas rubra sp.nov.的描述
        本章讨论
        本章小结
        参考文献
    第二章 乳氟禾草灵降解菌株的降解特性研究
        1 材料与方法
            1.1 培养基与菌株
            1.2 供试农药及化学试剂
            1.3 菌株的培养与种子液的制备
            1.4 菌株对乳氟禾草灵降解效果的测定
            1.5 环境因素对菌株降解乳氟禾草灵的影响
            1.6 菌株降解乳氟禾草灵的立体异构选择性
            1.7 菌株降解乳氟禾草灵的产物鉴定
        2 结果与分析
            2.1 菌株对乳氟禾草灵的降解效果
            2.2 温度对菌株降解乳氟禾草灵的影响
            2.3 初始pH对菌株降解乳氟禾草灵的影响
            2.4 外加不同碳氮源对菌株降解乳氟禾草灵的影响
            2.5 菌株降解乳氟禾草灵的立体异构选择性
            2.6 菌株对乳氟禾草灵的降解产物分析
        本章讨论
        本章小结
        参考文献
    第三章 乳氟禾草灵水解酶的基因克隆、表达及酶学特性研究
        第一节 乳氟禾草灵水解酶基因的克隆
            1 材料与方法
                1.1 培养基与化学试剂
                1.2 菌株和质粒
                1.3 高效感受态细胞的制备
                1.4 菌体总DNA的提取
                1.5 基因文库构建路线图
                1.6 总DNA的酶切与片段回收
                1.7 酶连与转化
                1.8 阳性克隆子对乳氟禾草灵降解效果测定
            2 结果与分析
                2.1 菌株总DNA的提取和Sau3 AI部分酶切
                2.2 阳性克隆子的筛选
                2.3 测序及ORF分析
                2.4 lacH和lacE核酸序列分析
                2.5 信号肽分析
                2.6 LacH和LacE氨基酸序列分析
                2.7 LacH和LacE在酯酶家族中的分类地位
        第二节 酯酶LacH和LacE的表达与纯化
            1 材料与方法
                1.1 培养基与化学试剂
                1.2 菌株和质粒
                1.3 普通感受态细胞的制备
                1.4 乳氟禾草灵水解酶基因的PCR扩增
                1.5 构建表达载体
                1.6 表达菌株的构建和诱导表达
                1.7 酯酶的纯化
                1.8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
                1.9 LacH和LacE的功能验证
            2 结果与分析
                2.1 lacH和lacE的PCR扩增
                2.2 乳氟禾草灵水解酶基因在大肠杆菌中的表达
                2.3 乳氟禾草灵水解酶的纯化
                2.4 LacH和LacE的功能验证
        第三节 酯酶LacH和LacE的酶学性质研究
            1 材料与方法
                1.1 化学试剂
                1.2 酶活力测定
                1.3 温度对酶活力的影响
                1.4 pH对酶活力的影响
                1.5 金属离子对酶活力的影响
                1.6 LacH和LacE对乳氟禾草灵异构体的选择性降解
            2 结果与分析
                2.1 LacH和LacE的底物谱及相应的动力学参数
                2.2 LacH和LacE的最适反应温度及热稳定性
                2.3 LacH和LacE的最适pH
                2.4 金属离子对酶活力的影响
                2.5 LacH和LacE对乳氟禾草灵异构体的选择性降解
        本章讨论
        本章小结
        参考文献
    第四章 菌株Za对玉米药害的解除效果研究
        第一节 氨基三氟羧草醚对玉米生长的影响研究
            1 材料与方法
                1.1 菌株、培养基与试剂
                1.2 供试土壤及种子
                1.3 氨基三氟羧草醚的制备
                1.4 供试土壤
                1.5 种子催芽
                1.6 盆栽试验
            2 结果与分析
                2.1 氨基三氟羧草醚对玉米幼苗株高的影响
                2.2 氨基三氟羧草醚对玉米植株根系的影响
        第二节 菌株Za对玉米药害的解除效果
            1 材料与方法
                1.1 培养基与试剂
                1.2 供试土壤及种子
                1.3 菌悬液的制备
                1.4 供试土壤
                1.5 种子催芽
                1.6 盆栽试验
            2 结果与分析
                2.1 投加菌株Za对玉米幼苗株高的恢复
                2.2 投加菌株Za对玉米幼苗根长的恢复
        本章讨论
        本章小结
        参考文献
全文总结
博士论文主要创新点
附录Ⅰ 培养基及试剂配方
附录Ⅱ 基因序列
攻读博士学位期间发表和待发表的论文
致谢



本文编号：3920369