氟虫腈诱导斑马鱼幼鱼及SH-SY5Y和HaCaT细胞的毒性效应与机理

发布时间：2024-02-27 08:57

氟虫腈作为苯吡唑类杀虫剂,因具有高效的杀虫活性,而一度被广泛地使用。但由于氟虫腈对环境中非靶标生物,尤其是水生生物造成严重危害,因此,多个国家已经限制其在农业上的使用。氟虫腈在环境中的残留所引发的对非靶标生物的高毒性成为环境科学领域研究的热点话题。本文通过二代测序、实时荧光定量PCR(qPCR)及流式细胞术等方法,研究了氟虫腈对斑马鱼幼鱼发育早期阶段的急性毒性作用以及氧化胁迫和神经信号传导相关基因的表达影响;氟虫腈诱导斑马鱼幼鱼的DGE表达谱分析及相关转录因子的初步探究;以及氟虫腈对人SH-SY5Y和HaCaT细胞的毒性作用,并且结合表型变化初步探索了氟虫腈的毒性机理。本文得到结果如下:1.发育75 hpf的斑马鱼幼鱼在氟虫腈中暴露96 h后的死亡率和畸形率显著升高,对应的LC_(50)和EC_(50)值分别为460μg/L和340μg/L;骨骼发育受到抑制导致体长显著变短;死亡率、畸形率及体长变化与氟虫腈浓度之间均呈现一定浓度依赖的关系。2.亚致死浓度下,斑马鱼幼鱼对氟虫腈产生了氧化应激反应。CAT、CES、GST、POD、SOD酶活性在浓度分别为0.5、5、50、100μg/L的氟虫腈处理72 h后均有不同程度的升高,且随着氟虫腈胁迫浓度的升高,酶活性均呈现先升高后降低的特征,都在氟虫腈浓度为5μg/L时,酶活性达到最大值。3.亚致死浓度下,氟虫腈影响了斑马鱼幼鱼神经信号传导相关基因ache、chat、glrba的表达。氟虫腈浓度分别为5、10、50、100μg/L时,基因的相对表达量均呈现随着暴露时间延长而升高。4.在环境浓度下,发育75 hpf的斑马鱼幼鱼在浓度为0.5、5、50μg/L的氟虫腈诱导72 h后的DGE表达谱分析结果显示,我们获得了一个高质量的DGE测序结果;3个浓度氟虫腈诱导下分别得到的差异表达基因数为58、75和98,其中上调基因数分别为2、4和7,下调基因数分别为56、71和91,各浓度下共同的差异表达基因数为44个,其中有9个为转录因子AP-1蛋白家族的编码基因;各浓度诱导下分别得到了12、112和23个显著富集的GO条目,包含生物过程和分子功能两个GO分类,各浓度诱导下共同富集到的GO条目主要涉及到细胞增殖、脂肪细胞代谢及转录因子活性;分别获得了7、6、9个显著富集的通路,其中HTLV-Ⅰinfection(ko05166)、Osteoclast differentiation(ko04380)和Hepatitis B(ko05161)为各浓度诱导下共同富集到的通路;qPCR验证结果显示,15个基因的相对表达量与DGE所得结果展现出高度的一致性,其Pearson’s相关系数r=0.97018且P0.001。5.分析了转录因子JDP2、Fosab和MIDN的编码基因在环境浓度为50μg/L的氟虫腈诱导下72 h后的相对表达量。JDP2和Fosab两个转录因子分别调控破骨细胞的生成与分化,推测jdp2b和fosab基因的显著下调表达能影响斑马鱼幼鱼的骨骼生长和发育,从而导致幼鱼脊柱弯曲或体长变短;JDP2能抑制细胞增殖及原癌基因的转化,推测jdp2b基因显著下调对发育早期的斑马鱼幼鱼有致癌风险;midn基因的相对表达量与氟虫腈的环境浓度呈现剂量依赖的关系,可以成为斑马鱼幼鱼对环境浓度氟虫腈响应的新的潜在生物标记物;此外,MIDN是帕金森病致病机制中重要的调控因子,推测氟虫腈诱导的midn基因的显著下调表达有诱发鱼类等脊椎动物出现类似帕金森病的风险。6.SH-SY5Y和HaCaT细胞都可以响应氟虫腈诱导而导致细胞存活率显著下降,且呈负相关性,HaCaT细胞对氟虫腈诱导表现得更加敏感;两种细胞的凋亡率都随氟虫腈浓度升高而升高,且随着氟虫腈作用时间的延长细胞凋亡率也在升高,表明氟虫腈对这两种人源细胞具有一定的毒害作用,且这种毒害会随着时间延长而累积。
【图文】：

图1.1氟虫腈化学结构式

图 1.1 氟虫腈化学结构式Fig. 1.1 chemical formula of fipronil相对密度 1.48-1.63（20℃），熔点 200-201℃。mg/L（20℃，，pH9）。易溶于有机溶剂，20℃下2 g/L，正己烷 0.028 g/L 等（李莎莎, 2015）。

图1.2氟虫腈在环境中的主要代谢途径

图 1.2 氟虫腈在环境中的主要代谢途径Fig. 1.2 Main metabolic pathways of fipronil in the environment腈的作用机理的活性很高并十分广谱，主要作用方式是胃毒，另外有触杀及中度内吸
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X171.5

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