基因工程方法实施蓝藻温度补偿突变体nktc1分子鉴定的研究
发布时间：2023-11-24 21:30
蓝藻Synechococcus elongatus PCC 7942(S.elongatus PCC 7942)是研究生物钟节律性的最简单模式生物之一,其基因组中绝大多数基因的转录活动都受到内源生物钟的调控。Kai ABC基因簇编码了该种蓝藻生物钟核心震荡器的基本分子组件,在蓝藻生物钟节律性的分子调控过程中起着至关重要作用。温度补偿特性是所有已知生物钟模型的基本属性之一,人们在以蓝藻S.elongatus PCC 7942为对象的生物钟节律性研究中发现,温度补偿属性的产生与维持往往与Kai基因家族的功能紧密相关。本实验室在前期工作中筛选得到一个Kai ABC基因簇序列完好,但生物节律性温度补偿属性表型为温度条件型的蓝藻突变体nktc1(Non-Kai Thermo-regulatory Component 1)。本论文以实验室保存的蓝藻S.elongatus PCC7942的nktc1突变体为对象采取基因工程方法对其温度补偿异常表型的分子机制进行了初步探究。本论文的具体研究内容如下:1.首先基于基因组测序和基因克隆的方法确定了nktc1的突变位点。相关实验结果表明nktc1突变体的准确...
【文章页数】：128 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 蓝藻生物钟研究进展
1.1.1 蓝藻生物钟Kai核心震荡器的研究进展
1.1.2 蓝藻Kai生物钟的离体震荡研究进展
1.1.3 与Kai生物节律性震荡器相关的其他生物钟组件研究进展
1.2 温度信号在蓝藻生物钟运转调控中作用的研究进展
1.2.1 环境温度信号可以影响生物钟相位牵引的过程
1.2.2 生物钟节律性的温度补偿特性研究进展
1.2.3 环境温度条件对生物节律性的限制作用研究进展
1.3 非Kai生物钟温度调控因子突变体nktc1(Non-Kai thermo-regulatory component,nktc1)
1.4 本论文的主要研究内容
第二章 nktc1蓝藻突变体突变位点的确定
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 材料
2.2.1.1 实验材料
2.2.1.2 主要试剂
2.2.1.3 主要仪器设备
2.2.2 方法
2.2.2.1 全基因组测序初步检测和定位nktc1突变体的突变位点
2.2.2.2 使用基因工程手段对基因组测序结果进行克隆测序,并验证其真实性
2.2.2.2.1 分子克隆中用到的引物
2.2.2.2.2 目的基因片段的PCR扩增体系及程序
2.2.2.2.3 PCR产物的测序和在线序列信息比对
2.3 结果
2.3.1 nktc1突变体基因组中的突变位点分析
2.3.1.1 nktc1突变体蓝藻全基因组测序发现的潜在突变位点分析
2.3.1.2 诱变亲本蓝藻S149全基因组测序SNP位点分析
2.3.1.3 全基因组测序结果的比较分析
2.3.2 假定nktc1突变位点的分子克隆及测序验证
2.3.2.1 不同藻株中CikA基因表达框序列比对结果
2.3.2.1.1 蓝藻数据库收录的野生型CikA基因表达框序列
2.3.2.1.2 蓝藻S149经PCR克隆得到的CikA基因表达框序列
2.3.2.1.3 nktc1 突变体中经PCR克隆得到的nktc-cikA突变基因ORF序列测序结果
2.3.2.2 不同藻株中RpaA序列测序结果
2.3.2.2.1 蓝藻数据库收录的野生型RpaA基因序列
2.3.2.2.2 基因克隆测序得到S149内RpaA序列
2.3.2.2.3 基因克隆测序得到nktc1内PCR克隆测序结果如下RpaA序列
2.4 讨论
第三章 nktc1 突变回复蓝藻藻株的基因工程构建及单一nktc位点突变重构藻株的获得
3.1 引言
3.2 材料及方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 实验方法
3.2.2.1 携带nktc-cikA突变位点的蓝藻转化载体构建
3.2.2.2 携带nktc-rpaA突变位点的蓝藻转化载体构建
3.2.2.3 nktc-cikA突变原位回复载体的构建
3.2.2.4 nktc-rpaA突变原位回复载体的构建
3.2.2.5 突变重建蓝藻藻株和突变回复蓝藻藻株的获得
3.3 结果
3.3.1 nktc-cikA或 nktc-rpaA突变位点重建载体及nktc突变位点回复载体的构建
3.3.1.1 nktc-cikA突变重建载体的构建及nktc-cikA突变位点重构蓝藻藻株的验证
3.3.1.2 nktc-rpaA突变重建载体的构建及nktc-rpaA突变位点重构蓝藻藻株的验证
3.3.1.3 nktc-cikA突变原位回复载体19T-CikA-R的构建
3.3.1.4 nktc-rpaA突变原位回复载体19T-RpaA-R的构建
3.3.1.5 nktc1 突变体的异位回复株系NS-CikA-R和 NS-RpaA-R及异位双回复株系的NS-CikA-RpaA-R的验证
3.4 讨论
第四章 nktc-cikA和 nktc-rpaA突变对蓝藻生物钟节律性温度补偿表型的影响分析
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料
4.2.1.1 实验材料
4.2.1.2 主要试剂
4.2.1.3 主要仪器设备
4.2.2 实验方法
4.2.2.1 RT-qPCR检测KaiC基因在不同蓝藻株系中的时序表达模式
4.2.2.1.1 不同蓝藻株系在温度驯化条件下时序样本的收集
4.2.2.1.2 TRIzol法进行总RNA的提取
4.2.2.1.3 基因组DNA的去除及c DNA的合成与纯化
4.2.2.1.4 RT-qPCR实验引物设计
4.2.2.2 Western Blot检测KaiC蛋白磷酸化节律性在不同蓝藻藻株中的表型
4.2.2.2.1 用于Western Blot实验蛋白提取的蓝藻时序样本收集
4.2.2.2.2 蓝藻蛋白的提取
4.2.2.2.3 蛋白电泳
4.2.2.2.4 Western blot
4.3 结果
4.3.1 KaiC基因在野生型蓝藻S149中的表达模式分析
4.3.1.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在野生型蓝藻S149 中的节律性表达模式
4.3.1.2 25℃/30℃低温温度驯化野生型蓝藻S149时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.2 KaiC基因在蓝藻nktc-cikA-m中的表达模式分析
4.3.2.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻nktc-cikA-m中的节律性表达模式
4.3.2.2 25℃/30℃低温温度驯化野生型蓝藻nktc-cikA-m时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.3 KaiC基因在野生型蓝藻nktc-rpaA-m中的表达模式分析
4.3.3.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻nktc-rpaA-m中的节律性表达模式
4.3.3.2 25℃/30℃低温温度驯化野生型蓝藻nktc-rpaA-m时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.4 KaiC基因在nktc1 突变藻株中的表达模式分析
4.3.4.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在nktc1 突变藻株中的节律性表达模式
4.3.4.2 25℃/30℃低温温度驯化nktc1 突变藻株时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.5 KaiC基因在蓝藻19T-CikA-R中的表达模式分析
4.3.5.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻19T-CikA-R中的节律性表达模式
4.3.5.2 25℃/30℃低温温度驯化蓝藻19T-CikA-R时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.6 KaiC基因在蓝藻19T-RpaA-R中的表达模式分析
4.3.6.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻19T-RpaA-R中的节律性表达模式
4.3.6.2 25℃/30℃低温温度驯化蓝藻19T-RpaA-R时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.7 KaiC基因在蓝藻NS-CikA-R中的表达模式分析
4.3.7.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻NS-CikA-R中的节律性表达模式
4.3.7.2 25℃/30℃低温温度驯化蓝藻NS-CikA-R时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.8 KaiC基因在蓝藻NS-RpaA-R中的表达模式分析
4.3.8.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻NS-RpaA-R中的节律性表达模式
4.3.8.2 25℃/30℃低温温度驯化蓝藻NS-RpaA-R时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.9 KaiC基因在蓝藻NS-CikA-RpaA-R中的表达模式分析
4.3.9.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻NS-CikA-RpaA-R中的节律性表达模式
4.3.9.2 25℃/30℃低温温度驯化蓝藻NS-CikA-RpaA-R时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.4 讨论
结论
参考文献
攻读硕士学位期间取得的科研成果
致谢
本文编号：3866631
【文章页数】：128 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 蓝藻生物钟研究进展
1.1.1 蓝藻生物钟Kai核心震荡器的研究进展
1.1.2 蓝藻Kai生物钟的离体震荡研究进展
1.1.3 与Kai生物节律性震荡器相关的其他生物钟组件研究进展
1.2 温度信号在蓝藻生物钟运转调控中作用的研究进展
1.2.1 环境温度信号可以影响生物钟相位牵引的过程
1.2.2 生物钟节律性的温度补偿特性研究进展
1.2.3 环境温度条件对生物节律性的限制作用研究进展
1.3 非Kai生物钟温度调控因子突变体nktc1(Non-Kai thermo-regulatory component,nktc1)
1.4 本论文的主要研究内容
第二章 nktc1蓝藻突变体突变位点的确定
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 材料
2.2.1.1 实验材料
2.2.1.2 主要试剂
2.2.1.3 主要仪器设备
2.2.2 方法
2.2.2.1 全基因组测序初步检测和定位nktc1突变体的突变位点
2.2.2.2 使用基因工程手段对基因组测序结果进行克隆测序,并验证其真实性
2.2.2.2.1 分子克隆中用到的引物
2.2.2.2.2 目的基因片段的PCR扩增体系及程序
2.2.2.2.3 PCR产物的测序和在线序列信息比对
2.3 结果
2.3.1 nktc1突变体基因组中的突变位点分析
2.3.1.1 nktc1突变体蓝藻全基因组测序发现的潜在突变位点分析
2.3.1.2 诱变亲本蓝藻S149全基因组测序SNP位点分析
2.3.1.3 全基因组测序结果的比较分析
2.3.2 假定nktc1突变位点的分子克隆及测序验证
2.3.2.1 不同藻株中CikA基因表达框序列比对结果
2.3.2.1.1 蓝藻数据库收录的野生型CikA基因表达框序列
2.3.2.1.2 蓝藻S149经PCR克隆得到的CikA基因表达框序列
2.3.2.1.3 nktc1 突变体中经PCR克隆得到的nktc-cikA突变基因ORF序列测序结果
2.3.2.2 不同藻株中RpaA序列测序结果
2.3.2.2.1 蓝藻数据库收录的野生型RpaA基因序列
2.3.2.2.2 基因克隆测序得到S149内RpaA序列
2.3.2.2.3 基因克隆测序得到nktc1内PCR克隆测序结果如下RpaA序列
2.4 讨论
第三章 nktc1 突变回复蓝藻藻株的基因工程构建及单一nktc位点突变重构藻株的获得
3.1 引言
3.2 材料及方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 实验方法
3.2.2.1 携带nktc-cikA突变位点的蓝藻转化载体构建
3.2.2.2 携带nktc-rpaA突变位点的蓝藻转化载体构建
3.2.2.3 nktc-cikA突变原位回复载体的构建
3.2.2.4 nktc-rpaA突变原位回复载体的构建
3.2.2.5 突变重建蓝藻藻株和突变回复蓝藻藻株的获得
3.3 结果
3.3.1 nktc-cikA或 nktc-rpaA突变位点重建载体及nktc突变位点回复载体的构建
3.3.1.1 nktc-cikA突变重建载体的构建及nktc-cikA突变位点重构蓝藻藻株的验证
3.3.1.2 nktc-rpaA突变重建载体的构建及nktc-rpaA突变位点重构蓝藻藻株的验证
3.3.1.3 nktc-cikA突变原位回复载体19T-CikA-R的构建
3.3.1.4 nktc-rpaA突变原位回复载体19T-RpaA-R的构建
3.3.1.5 nktc1 突变体的异位回复株系NS-CikA-R和 NS-RpaA-R及异位双回复株系的NS-CikA-RpaA-R的验证
3.4 讨论
第四章 nktc-cikA和 nktc-rpaA突变对蓝藻生物钟节律性温度补偿表型的影响分析
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料
4.2.1.1 实验材料
4.2.1.2 主要试剂
4.2.1.3 主要仪器设备
4.2.2 实验方法
4.2.2.1 RT-qPCR检测KaiC基因在不同蓝藻株系中的时序表达模式
4.2.2.1.1 不同蓝藻株系在温度驯化条件下时序样本的收集
4.2.2.1.2 TRIzol法进行总RNA的提取
4.2.2.1.3 基因组DNA的去除及c DNA的合成与纯化
4.2.2.1.4 RT-qPCR实验引物设计
4.2.2.2 Western Blot检测KaiC蛋白磷酸化节律性在不同蓝藻藻株中的表型
4.2.2.2.1 用于Western Blot实验蛋白提取的蓝藻时序样本收集
4.2.2.2.2 蓝藻蛋白的提取
4.2.2.2.3 蛋白电泳
4.2.2.2.4 Western blot
4.3 结果
4.3.1 KaiC基因在野生型蓝藻S149中的表达模式分析
4.3.1.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在野生型蓝藻S149 中的节律性表达模式
4.3.1.2 25℃/30℃低温温度驯化野生型蓝藻S149时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.2 KaiC基因在蓝藻nktc-cikA-m中的表达模式分析
4.3.2.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻nktc-cikA-m中的节律性表达模式
4.3.2.2 25℃/30℃低温温度驯化野生型蓝藻nktc-cikA-m时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.3 KaiC基因在野生型蓝藻nktc-rpaA-m中的表达模式分析
4.3.3.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻nktc-rpaA-m中的节律性表达模式
4.3.3.2 25℃/30℃低温温度驯化野生型蓝藻nktc-rpaA-m时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.4 KaiC基因在nktc1 突变藻株中的表达模式分析
4.3.4.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在nktc1 突变藻株中的节律性表达模式
4.3.4.2 25℃/30℃低温温度驯化nktc1 突变藻株时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.5 KaiC基因在蓝藻19T-CikA-R中的表达模式分析
4.3.5.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻19T-CikA-R中的节律性表达模式
4.3.5.2 25℃/30℃低温温度驯化蓝藻19T-CikA-R时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.6 KaiC基因在蓝藻19T-RpaA-R中的表达模式分析
4.3.6.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻19T-RpaA-R中的节律性表达模式
4.3.6.2 25℃/30℃低温温度驯化蓝藻19T-RpaA-R时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.7 KaiC基因在蓝藻NS-CikA-R中的表达模式分析
4.3.7.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻NS-CikA-R中的节律性表达模式
4.3.7.2 25℃/30℃低温温度驯化蓝藻NS-CikA-R时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.8 KaiC基因在蓝藻NS-RpaA-R中的表达模式分析
4.3.8.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻NS-RpaA-R中的节律性表达模式
4.3.8.2 25℃/30℃低温温度驯化蓝藻NS-RpaA-R时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.3.9 KaiC基因在蓝藻NS-CikA-RpaA-R中的表达模式分析
4.3.9.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在蓝藻NS-CikA-RpaA-R中的节律性表达模式
4.3.9.2 25℃/30℃低温温度驯化蓝藻NS-CikA-RpaA-R时序样本中KaiC磷酸化状态的节律性表型的Western Blot分析
4.4 讨论
结论
参考文献
攻读硕士学位期间取得的科研成果
致谢
本文编号：3866631
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