辅助成分蛋白酶和柱状内含体蛋白在马铃薯Y病毒病症状形成过程中的作用机制
发布时间：2020-04-03 06:52
【摘要】：马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是最大的植物RNA病毒属—马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的代表种,其基因组编码两个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),在自身蛋白酶的作用下切割成11个成熟蛋白,其中,辅助成分蛋白酶(Helper component proteinase,HCpro)参与病毒的复制、RNA沉默抑制、蚜虫传毒和症状形成等重要生命过程。圆柱状内含体蛋白(Cytoplasmic inclusion protein,CI)在病毒侵染的细胞中形成的风轮状内含体是马铃薯Y病毒科Potyviridae病毒鉴定的重要特征,同时参与病毒复制、细胞间移动和症状形成等过程。HCpro与CI参与症状形成过程,但具体机制还不清楚。研究表明HCpro的三维结构与抗性基因的识别密切相关,暗示HCpro三维结构在病毒症状形成过程中具有重要作用。对CI编码的氨基酸序列分析发现PVY CI的C端存在真核生物翻译起始因子eIF4E的潜在结合基序:YxxxxLΦ基序。为研究HCpro和CI在症状形成过程中的作用,本研究在PVY~N605侵染性克隆基础上,分别将HCpro不同位置插入标签序列,分析HCpro三维结构与症状之间的关系,通过定点突变技术突变YxxxxLΦ基序中保守位点鉴定该基序在病毒症状形成过程中作用。具体结果如下:(1)HCpro结构变化影响PVY症状形成。N端与中心区域对PVY的症状形成的影响更大。在PVY~N605侵染性克隆基础上,将标签序列IDAGGS分别插入HCpro的N端区域、中心区域和C端区域氨基酸S_1S_2、I_(252)V_(253)和L_(313)V_(314),获得PVY-HCS_1-S_2、PVY-HCI_(252)-V_(253)、PVY-HCL_(313)-V_(314)突变体。通过农杆菌浸润的方法将野生型及其突变体病毒接种本氏烟。结果显示,所有的突变体均能够系统侵染本氏烟。接种4天后PVY-HCS_1-S_2突变体能够移动到系统叶片;接种后25天,与PVY野生型病毒相比,接种PVY-HCS_1-S_2突变体引起寄主系统叶片严重皱缩,植株明显矮化。接种4天后,未能在本氏烟系统叶片检测到PVY-HCI_(252)-V_(253)突变体,但接种后25天可在系统叶片观察到绿色荧光。接种突变体PVY-HCL_(313)-V_(314)25天后本氏烟的症状与野生型相比无显著差异。(2)在HCpro不同区域插入标签序列影响HCpro抑制沉默能力。将标签序列IDAGGS分别插入瞬时表达载体pCa-35S:HCpro的N端区域、中心区域和C端区域氨基酸S_1S_2、I_(252)V_(253)和L_(313)V_(314),获得野生型HCpro及突变体HCproS_1-S_2、HCproI_(252)-V_(253)、HCproL_(313)-V_(314)的瞬时表达载体。抑制RNA沉默试验结果显示,与野生型相比,突变体HCproS_1-S_2抑制RNA沉默能力增强,突变体HCproI_(252)-V_(253)抑制RNA沉默能力显著减弱,突变体HCproL_(313)-V_(314)的抑制RNA沉默能力与野生型相比无明显差异,表明HCpro不同区域的特定结构或序列在抑制RNA沉默过程中具有重要作用。(3)突变CI中YxxxxLΦ基序影响PVY的症状形成。将PVY CI中潜在的eIF4E识别基序YxxxxLΦ基序中保守位点Y、L突变为A,获得PVY-CI_(Y513AL518A)突变体。通过农杆菌浸润方法分别接种本氏烟、普通烟,结果显示,与野生型相比,PVY-CI_(Y513AL518A)突变体病毒RNA和蛋白积累水平降低,病毒扩散能力减弱。(4)未发现CI中YxxxxLΦ基序与eIF4E互作的充分证据。已有研究表明YxxxxLΦ基序普遍存在于eIF4E互作蛋白中。构建含野生型PVY-CI与及突变体CI_(Y513AL518A)全长编码序列,和CI及突变体CI_(Y513AL518A)C端的酵母表达载体,结果未发现CI通过YxxxxLΦ基序与eIF4E、eIF(iso)4E互作证据。构建CI及突变体CI_(Y513AL518A)、eIF4E、eIF(iso)4E的BiFC载体,结果发现CI及突变体CI_(Y513AL518A)均与eIF4E体内存在互作。
【图文】：
1995；Kasschau et al.,1997；Plisson et al.,2003），可以将 HCpro 分为 3 个不同的结构域：N 端区域、中心区域和 C 端区域（如图 1-2）。N 端区域包含一个富含半胱氨酸的区域，该区域存在 KITC 基序，与 C 端区域的 PTK 基序共同参与病毒的蚜传过程（Blanc et al.,1998；Blanc et al., 1997；Peng et al., 1998），N 端区域还参与病毒基因组的复制、系统移动、病毒症状形成等过程（Atreya et al., 1992；Kasschau et al., 1997；Revers et al., 1999；Seo et al., 2011；Yun-Kiam et al., 2009）；中心区域参与病毒基因组的复制（IGN 基序）（Kasschau et al., 1997）、RNA 沉默抑制（FRNK 基序）（Varrelmann et al., 2007）和病毒系统侵染（CC/SC 基序）（Cronin et al., 1995），还可以调控与其它病毒的协生过程（鲁瑞芳等，2001）；C 端具有番木瓜蛋白酶活性，可以催化自身在甘氨酸/甘氨酸处与多聚蛋白的分离（Guo et al., 2011），同时它还参与病毒的细胞间移动（Carrington et al., 1989b；Varrelmann et al., 2007）和抑制 RNA 沉默的过程（Urcuqui-Inchima et al., 2000；Urcuqui-Inchima et al., 1999）。
YTHS 作用原理如图 1-3 所示，转录因子 DNA 结合区域（DNA Binding Domai-BD）和转录因子激活区域（Activation Domain, DNA-AD），两个结构域相互独立合于人工合成的 GAL 报告基因的上游激活序列（upstream activating sequenc ），BD 携带诱饵（Bait）蛋白，AD 与猎物（Prey）蛋白相融合。如果与 BD、A的诱饵蛋白与猎物蛋白两蛋白质能够互作，则会互相靠近，建立物理联系，使 AD合，发挥转录因子活性，激活报告基因表达，由此，，蛋白间的互作与否可由报告表达与否进行体现。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.41
本文编号：2613086
【图文】：
1995；Kasschau et al.,1997；Plisson et al.,2003），可以将 HCpro 分为 3 个不同的结构域：N 端区域、中心区域和 C 端区域（如图 1-2）。N 端区域包含一个富含半胱氨酸的区域，该区域存在 KITC 基序，与 C 端区域的 PTK 基序共同参与病毒的蚜传过程（Blanc et al.,1998；Blanc et al., 1997；Peng et al., 1998），N 端区域还参与病毒基因组的复制、系统移动、病毒症状形成等过程（Atreya et al., 1992；Kasschau et al., 1997；Revers et al., 1999；Seo et al., 2011；Yun-Kiam et al., 2009）；中心区域参与病毒基因组的复制（IGN 基序）（Kasschau et al., 1997）、RNA 沉默抑制（FRNK 基序）（Varrelmann et al., 2007）和病毒系统侵染（CC/SC 基序）（Cronin et al., 1995），还可以调控与其它病毒的协生过程（鲁瑞芳等，2001）；C 端具有番木瓜蛋白酶活性，可以催化自身在甘氨酸/甘氨酸处与多聚蛋白的分离（Guo et al., 2011），同时它还参与病毒的细胞间移动（Carrington et al., 1989b；Varrelmann et al., 2007）和抑制 RNA 沉默的过程（Urcuqui-Inchima et al., 2000；Urcuqui-Inchima et al., 1999）。
YTHS 作用原理如图 1-3 所示，转录因子 DNA 结合区域（DNA Binding Domai-BD）和转录因子激活区域（Activation Domain, DNA-AD），两个结构域相互独立合于人工合成的 GAL 报告基因的上游激活序列（upstream activating sequenc ），BD 携带诱饵（Bait）蛋白，AD 与猎物（Prey）蛋白相融合。如果与 BD、A的诱饵蛋白与猎物蛋白两蛋白质能够互作，则会互相靠近，建立物理联系，使 AD合，发挥转录因子活性，激活报告基因表达，由此，，蛋白间的互作与否可由报告表达与否进行体现。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.41
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 鲁瑞芳,李为民,王海云,郭明,彭学贤;马铃薯Y病毒HC-Pro中心区域在病毒协生作用中的主导地位[J];生物工程学报;2001年03期
本文编号：2613086
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