纳豆芽胞杆菌中MenA的异源过表达

发布时间：2020-04-02 05:07

【摘要】：维生素K2(VK2,MK-n)又叫甲萘醌,是人体新陈代谢中不可缺少的脂溶性维生素,具有多种重要的生理功能。纳豆芽胞杆菌作为生产VK2的主要菌种,其VK2产量较高,是美国FDA公认的益生菌。有研究表明,在大肠杆菌中将VK2合成关键酶1,4-二羟基-2-萘甲酸聚异戊二烯转移酶(EcMenA)进行过表达,可以显著提高VK2的产量。而纳豆芽胞杆菌中1,4-二羟基-2-萘甲酸聚异戊二烯转移酶(BsnMenA)在天然生物体中丰度较低,目前仍较少被研究报道,因此对于BsnMenA的晶体结构以及具体催化过程还不清楚。本课题对BsnMenA分别进行了生物信息学预测分析,亚细胞定位实验以及在大肠杆菌中克隆与表达的研究,这为后期开展BsnMenA的深入研究奠定理论基础。主要研究内容和结果如下:(1)通过生物信息学软件对BsnMenA的系统进化关系、基本性质、跨膜结构、亲疏水性、结构域的预测与motifs搜索、空间结构等进行预测分析。系统进化树显示,芽胞杆菌属中的MenA高度相似,亲缘关系较近,但与大肠杆菌等其它科中的MenA亲缘关系较远。从理化性质及亚细胞定位预测,初步确定BsnMenA属于膜结合型蛋白质。结构域与motifs搜索预测显示,BsnMenA的34-278氨基酸组成典型的UbiA结构功能域,其中74-84和204-212分别存在NxxxDxxxxxD和NNxxDxxxD的Asp-rich motifs结构。同源序列比对发现BsnMenA中第74、204、205天冬酰胺和208、84、78、212天冬氨酸是其关键氨基酸位点。通过折叠识别建模法,模拟出BsnMenA的三维空间结构,是由9个跨膜螺旋组成的一个活性中心腔,这与匹配度最高的嗜热系古生细菌中的4-羟苯甲酸-聚异戊二烯转移酶(ApUbiA)极其相似,由于BsnMenA与ApUbiA空间结构高度相似,因此推导出BsnMenA的催化功能有关的保守结构域位点及其催化机制。(2)为了进一步探究BsnMenA在大肠杆菌中的亚细胞定位情况,本章节通过重叠 PCR扩增法,成功构建了重组菌BL21/pET28a-menA-egfp(MEP28)和BL21/pET28a-egfp-menA(EMP28),随后对这两株重组菌以及阳性对照BL21/pET28a-egfp(EP28)和阴性对照BL21/pET28a(P28),以相同的培养条件下进行发酵和诱导表达,诱导条件为IPTG浓度0.2 mM,诱导温度28℃,摇瓶转速150 rpm,并采取实时取样的方式。将诱导发酵结束后的样品用激光共聚焦荧光显微镜观察,显示结果为:当诱导时间为20 min时,重组菌MEP28和EMP28的细胞膜上均有明显可见荧光,而阳性对照EP28整个细胞布满荧光,阴性对照P28则未见明显的荧光。该实验不仅再次验证BsnMenA是膜蛋白,而且充分说明膜蛋白menA以及egfp在大肠杆菌中可以表达并且正确折叠。(3)为了深入研究BsnMenA在大肠杆菌中的克隆与过表达情况。首先,经PCR扩增得到的menA分别与pET22b(+)和pET28a(+)连接,并转入大肠杆菌JM109中,得到重组菌JM109/pET28a-menA和JM109/pET22b-menA,将发酵后提取重组质粒转入BL21(DE3)中,得到重组菌BL21/pET28a-menA(MP28)和BL21/pET22b-menA(MP22)。其次,以LB培养基为发酵培养基时,将MP22、MP28以及阴性对照BL21/pET22b(P22)和BL21/pET28a(P28)在IPTG终浓度分别为0.2 mM和0.8 mM条件下,进行低温诱导表达,通过制备BsnMenA的粗提样品并进行SDS-PAGE检测,均无明显可见蛋白条带。再次,以含有0.5%葡萄糖的LB培养基为发酵培养基时,将MP22、MP28、P22和P28在0.5 mM的IPTG中,进行低温诱导表达,SDS-PAGE检测发现MP22在38 KD处有明显可见蛋白条带,而在MP28的蛋白电泳图中却未见明显条带。通过本实验,发现MP22在0.5%葡萄糖的LB培养基中具有过表达BsnMenA的潜力,并且初步建立了适合BsnMenA异源过表达的方法。为后期对MP22进行系统性发酵条件优化、BsnMenA纯品的获得以及酶学性质的研究奠定一定的理论基础。
【图文】：

维生素Ｅ、紫草素和异戊烯类黄酮等的生物合成ＰＩ，该种类型的蛋白酶一级结构逡逑中均含有一段与异戊烯结合有关的天冬氨酸结构域序列（Ｎ／Ｄ）ＤＸＸＤ，空间结构逡逑一般为ａ螺旋组成的多个跨膜结构域，见图１－２邋（ａ），催化反应需要二价金属离逡逑子Ｍｇ２＋或Ｍｎ２＋等参与［２２］，将疏水性的异戊烯侧链转移到芳香族化合物主链上，逡逑发生傅克－院基化反应，且仅催化Ｃ－异戊烯基化反应，其中ＵｂｉＡ酶的晶体结构逡逑己经被报道，空间结构为由９个跨膜螺旋组成一个催化活性有关的活性中心腔，逡逑并穿插在细胞膜的胞质膜上［２３］。尽管膜结合型芳香族异戊烯转移酶具有重要的逡逑生物学意义，但由于难以实现高产量的过表达以及不易用生物化学方法处理这些逡逑３逡逑Ｉ逡逑

来源于真菌和细菌，该类蛋白酶是可溶性的，氨基酸的一级结构不包含天冬氨酸逡逑模体，空间结构为特殊的ａ－ｐ－ｐ－ａ组成的ＰＴ桶状结构，其中ａ螺旋包围ｐ桶状逡逑结构，并且由十个反向平行的Ｐ折叠片层构成的全新构象，见图１－２邋（ｂ），另外逡逑Ｐ桶状结构中含有底物结合口袋［２５，２６］，部分酶催化反应时并不需要Ｍｇ２＋等离子逡逑的参与，而且催化形成Ｃ－Ｃ键，Ｃ－０键，（：以键［２１，２７］，近年来，水溶性异戊烯逡逑转移酶相比较膜结合型异戊烯转移酶，易于异源过表达，所以研究较为普遍［２３］。逡逑大肠杆菌中ＥｃＭｅｎＡ由Ｓｈｉｎｅｂｅｒｇ和Ｙｏｕｎｇ等人发现，，在法尼焦磷酸和镁离逡逑子存在条件下，该酶可以将大肠杆菌粗膜中ＤＨＮＡ转换成ＭＫ或ＤＭＫ［２８］。随逡逑后Ｋ．邋ＳＵＶＡＲＮＡ等通过分子生物学技术，鉴定了邋ＥｃＭｅｎＡ是一段含有３０８密码逡逑子开放阅读框，定位于基因组和ｇ／／成之间的２．０ｋｂ区域［２９］。文献研究表明，逡逑ＭｅｎＡ属于膜结合型芳香族异戊烯转移酶ＵｂｉＡ超家族成员［１
【学位授予单位】：安徽工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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本文编号：2611498