抗黄曲霉毒素B 1 纳米抗体免疫学性能分析及其随机突变库的研究
发布时间：2024-04-20 14:09
黄曲霉毒素B1(AFB1)分布广泛,可以致癌、致畸和致突变,且在食品中检出率较高,严重威胁人类和动物的健康。酶联免疫分析技术和胶体金免疫层析技术因其特异性强、高通量、简单快速、低成本等优点成为检测黄曲霉毒素的常用方法之一。然而,随着人们对食品安全和质量的要求越来越严格,这两种免疫学分析方法由于其检测灵敏度偏低的局限性,已经无法满足某些实际应用的需求。因此如何提高这两大免疫学检测方法的灵敏度已成为当前亟待解决的主要问题。驼源性纳米抗体作为目前体积最小的基因工程抗体,具有稳定性高、生产周期短、产量高,易于遗传信息改造、成本低等优点,已经被广泛应用于食品安全检测等领域。为了提高酶联免疫分析技术和胶体金免疫层析技术的检测灵敏度,本文以驼源性纳米抗体为主要实验材料,紧紧围绕着提高检测信号的灵敏度和改进免疫学元件亲和力两个策略进行了如下研究:1生物素化纳米抗体的制备及应用的研究(策略一:提高检测信号的灵敏度)通过化学生物素法和酶催化生物素法标记纳米抗体,得到了三种生物素化纳米抗体,即G8-L-Biotin(长臂)、G8-S-Biotin(短臂)和G8-B...
【文章页数】：126 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语
第1章 引言
1.1 黄曲霉毒素B1的研究进展
1.1.1 黄曲霉毒素B
1.1.2 AFB1 的限量标准
1.1.3 AFB1 免疫学检测方法的研究进展
1.2 纳米抗体技术研究进展
1.2.1 纳米抗体的特点
1.2.2 纳米抗体在小分子化合物检测中的应用
1.2.3 纳米抗体的进化
1.3 主要研究内容和意义
1.3.1 研究内容
1.3.2 研究意义
第2章 基于抗AFB1生物素化纳米抗体融合蛋白的研究
2.1 材料、仪器与试剂
2.1.1 主要材料
2.1.2 主要仪器
2.1.3 主要溶液和培养基
2.2 方法与步骤
2.2.1 化学生物素标记法
2.2.2 表达载体pINQ-BtH6-G8 的构建及转化
2.2.3 融合蛋白的表达、纯化及鉴定
2.2.4 酶催化生物素法和化学生物素法制备的生物素纳米抗体灵敏度的比较
2.2.5 基于G8-Biotin融合蛋白免疫分析法(BAS-FLEIA)的建立
2.3 实验结果
2.3.1 质粒pINQ-BtH6-G8 的构建
2.3.2 融合蛋白G8-Biotin的诱导表达、纯化及鉴定
2.3.3 纳米抗体融合前后的活性分析
2.2.4 酶催化生物素法和化学生物素法标记纳米抗体G8对AFB1 抑制曲线的影响
2.2.5 基于G8-Biotin建立了检测谷物中AFB1的BAS-FLEIA
2.2.6 实际样品的检测
2.4 讨论与小结
2.4.1 讨论
2.4.2 小结
第3章 抗AFB1纳米抗体-荧光素酶融合蛋白表达及应用的研究
3.1 材料、仪器与试剂
3.1.1 主要材料
3.1.2 主要仪器
3.1.3 试剂
3.2 方法与步骤
3.2.1 原核表达载体pET22b(+)-G8-Nluc的构建
3.2.2 融合蛋白G8-Nluc的表达
3.2.3 融合蛋白G8-Nluc活性分析
3.2.4 基于G8-Nluc直接竞争一步生物荧光酶联免疫分析法的建立
3.2.5 One-step BLEIA反应体系的优化
3.2.6 基于G8-Nluc的直接竞争一步生物荧光酶联免疫分析法的验证
3.3 实验结果
3.3.1 原核表达载体pET22b-G8-Nluc构建
3.3.2 G8-Nluc融合蛋白的制备
3.3.3 pET22b-G8-Nluc的活性分析
3.3.4 基于G8-Nluc融合蛋白建立直接竞争一步生物荧光酶联免疫分析法
3.4 讨论与小结
3.4.1 讨论
3.4.2 小结
第4章 基于G8-CTB和花状纳米金免疫层析检测技术检测黄曲霉毒素B1 的应用研究
4.1 实验材料
4.1.1 主要材料及试剂
4.1.2 仪器设备
4.1.3 主要溶剂和培养基
4.2 方法与步骤
4.2.1 五价纳米抗体载体pET-CT-G8 的构建及融合蛋白的表达
4.2.3 胶体金的制备与表征
4.2.4 试纸条组装
4.2.5 胶体金探针的制备
4.2.6 试纸条的制备
4.2.7 免疫层析试纸条免疫反应分析
4.2.8 试纸条性能的优化
4.3 实验结果
4.3.1 纳米抗体活性的鉴定
4.3.2 AuNFs溶液的制备及鉴定
4.3.3 金标探针合成最适pH值和纳米抗体量的优化
4.3.4 纳米抗体试纸条的制备
4.3.5 胶体金试纸条性能的测定
4.4 讨论与小结
4.4.1 讨论
4.4.2 小结
第5章 抗AFB1 纳米抗体随机突变库的构建、淘选和鉴定
5.1 材料、仪器和试剂
5.1.1 主要材料和试剂
5.1.2 主要仪器
5.1.3 主要溶液和培养基
5.2 方法与步骤
5.2.1 突变文库的构建(易错PCR)
5.2.2 随机突变库的亲和淘选
5.2.3 间接竞争phage-ELISA分析阳性克隆的活性
5.3 实验结果
5.3.1 易错PCR条件的优化
5.3.2 随机突变文库的鉴定
5.3.3 抗AFB1 纳米抗体随机突变库的淘选
5.3.4 噬菌粒的救援与鉴定
5.3.5 阳性克隆序列与活性分析
5.3.6 突变子灵敏度变化机制的讨论
5.4 讨论与小结
5.4.1 讨论
5.4.2 小结
第6章 结论与展望
6.1 结论
6.1.1 生物素化纳米抗体的制备及应用
6.1.2 纳米抗体-纳米荧光素酶(G8-Nluc)的融合表达、活性分析及应用
6.1.3 基于五价纳米抗体单体的免疫层析检测技术的研究和应用
6.1.4 抗AFB1 纳米抗体随机突变库的构建、淘选和鉴定
6.2 展望
6.3 创新点
致谢
参考文献
附录A 氨基酸基本信息表
攻读学位期间的研究成果
本文编号：3959523
【文章页数】：126 页
【学位级别】：博士
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摘要
ABSTRACT
缩略语
第1章 引言
1.1 黄曲霉毒素B1的研究进展
1.1.1 黄曲霉毒素B
1.1.2 AFB1 的限量标准
1.1.3 AFB1 免疫学检测方法的研究进展
1.2 纳米抗体技术研究进展
1.2.1 纳米抗体的特点
1.2.2 纳米抗体在小分子化合物检测中的应用
1.2.3 纳米抗体的进化
1.3 主要研究内容和意义
1.3.1 研究内容
1.3.2 研究意义
第2章 基于抗AFB1生物素化纳米抗体融合蛋白的研究
2.1 材料、仪器与试剂
2.1.1 主要材料
2.1.2 主要仪器
2.1.3 主要溶液和培养基
2.2 方法与步骤
2.2.1 化学生物素标记法
2.2.2 表达载体pINQ-BtH6-G8 的构建及转化
2.2.3 融合蛋白的表达、纯化及鉴定
2.2.4 酶催化生物素法和化学生物素法制备的生物素纳米抗体灵敏度的比较
2.2.5 基于G8-Biotin融合蛋白免疫分析法(BAS-FLEIA)的建立
2.3 实验结果
2.3.1 质粒pINQ-BtH6-G8 的构建
2.3.2 融合蛋白G8-Biotin的诱导表达、纯化及鉴定
2.3.3 纳米抗体融合前后的活性分析
2.2.4 酶催化生物素法和化学生物素法标记纳米抗体G8对AFB1 抑制曲线的影响
2.2.5 基于G8-Biotin建立了检测谷物中AFB1的BAS-FLEIA
2.2.6 实际样品的检测
2.4 讨论与小结
2.4.1 讨论
2.4.2 小结
第3章 抗AFB1纳米抗体-荧光素酶融合蛋白表达及应用的研究
3.1 材料、仪器与试剂
3.1.1 主要材料
3.1.2 主要仪器
3.1.3 试剂
3.2 方法与步骤
3.2.1 原核表达载体pET22b(+)-G8-Nluc的构建
3.2.2 融合蛋白G8-Nluc的表达
3.2.3 融合蛋白G8-Nluc活性分析
3.2.4 基于G8-Nluc直接竞争一步生物荧光酶联免疫分析法的建立
3.2.5 One-step BLEIA反应体系的优化
3.2.6 基于G8-Nluc的直接竞争一步生物荧光酶联免疫分析法的验证
3.3 实验结果
3.3.1 原核表达载体pET22b-G8-Nluc构建
3.3.2 G8-Nluc融合蛋白的制备
3.3.3 pET22b-G8-Nluc的活性分析
3.3.4 基于G8-Nluc融合蛋白建立直接竞争一步生物荧光酶联免疫分析法
3.4 讨论与小结
3.4.1 讨论
3.4.2 小结
第4章 基于G8-CTB和花状纳米金免疫层析检测技术检测黄曲霉毒素B1 的应用研究
4.1 实验材料
4.1.1 主要材料及试剂
4.1.2 仪器设备
4.1.3 主要溶剂和培养基
4.2 方法与步骤
4.2.1 五价纳米抗体载体pET-CT-G8 的构建及融合蛋白的表达
4.2.3 胶体金的制备与表征
4.2.4 试纸条组装
4.2.5 胶体金探针的制备
4.2.6 试纸条的制备
4.2.7 免疫层析试纸条免疫反应分析
4.2.8 试纸条性能的优化
4.3 实验结果
4.3.1 纳米抗体活性的鉴定
4.3.2 AuNFs溶液的制备及鉴定
4.3.3 金标探针合成最适pH值和纳米抗体量的优化
4.3.4 纳米抗体试纸条的制备
4.3.5 胶体金试纸条性能的测定
4.4 讨论与小结
4.4.1 讨论
4.4.2 小结
第5章 抗AFB1 纳米抗体随机突变库的构建、淘选和鉴定
5.1 材料、仪器和试剂
5.1.1 主要材料和试剂
5.1.2 主要仪器
5.1.3 主要溶液和培养基
5.2 方法与步骤
5.2.1 突变文库的构建(易错PCR)
5.2.2 随机突变库的亲和淘选
5.2.3 间接竞争phage-ELISA分析阳性克隆的活性
5.3 实验结果
5.3.1 易错PCR条件的优化
5.3.2 随机突变文库的鉴定
5.3.3 抗AFB1 纳米抗体随机突变库的淘选
5.3.4 噬菌粒的救援与鉴定
5.3.5 阳性克隆序列与活性分析
5.3.6 突变子灵敏度变化机制的讨论
5.4 讨论与小结
5.4.1 讨论
5.4.2 小结
第6章 结论与展望
6.1 结论
6.1.1 生物素化纳米抗体的制备及应用
6.1.2 纳米抗体-纳米荧光素酶(G8-Nluc)的融合表达、活性分析及应用
6.1.3 基于五价纳米抗体单体的免疫层析检测技术的研究和应用
6.1.4 抗AFB1 纳米抗体随机突变库的构建、淘选和鉴定
6.2 展望
6.3 创新点
致谢
参考文献
附录A 氨基酸基本信息表
攻读学位期间的研究成果
本文编号：3959523
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/qgylw/3959523.html