进化工程改造芽孢杆菌生产3-羟基丁酮

发布时间：2020-03-29 02:45

【摘要】：3-羟基丁酮是一种具有特殊的奶油香气的平台化学品,广泛应用于食品添加剂、制药和化工等领域。微生物发酵法生产3-羟基丁酮由于满足可持续发展理念而日益受到瞩目。多数芽孢杆菌作为一般认为安全的(GRAS)菌株具有天然合成3-羟基丁酮的代谢路径,但其产量由于菌株耐受性等因素的限制还不能达到工业化制备的要求。本研究通过结合进化工程策略和代谢工程方法,对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行传统复合诱变、自主适应性进化,强化了3-羟基丁酮的耐受表型,提高了工程菌株3-羟基丁酮的生产性能。主要研究内容如下:1.高产3-羟基丁酮芽孢杆菌的传统突变选育。采用常压室温等离子体(ARTP)和~(60)Coγ射线对B.amyloliquefaciens FMME088进行复合诱变,以3-羟基丁酮产量为分析指标,通过摇瓶水平的两轮筛选获得最优突变株B.amyloliquefaciens H-5,3-羟基丁酮产量为68.2 g·L~(-1)。为实现3-羟基丁酮的高效生产,进一步对此突变株进行5-L发酵罐水平的培养条件优化,并于30-L发酵罐上进行放大培养,最终3-羟基丁酮产量达85.2 g·L~(-1),较出发菌株B.amyloliquefaciens FMME088提高了26.8%。2.自主进化突变系统(AEMS)的设计与构建。首先,为了确定启动子P_(srfA)是否满足群体感应(quorum sensing,QS)的自诱导性能,在B.subtilis 168中表达了由P_(srfA)启动的增强型绿色荧光蛋白(EGFP),其荧光表达强度随细胞生长状态的变化而变化,并在细胞生长至对数中后期(8~12 h),OD_(600)为1.0~2.2时表达显著增加。其次,为了提高启动子P_(srfA)的转录活性,使用保守序列TTGACA和TATAAT替换P_(srfA)的-35区和-10区,通过检测荧光表达强度发现,由-35区被替换的启动子P_(TH11)启动的EGFP荧光强度提高了40%。另外,对P_(TH11)的上游序列进行不同长度的截断,其中P_(JD15)(-136~+291)启动的EGFP荧光强度最大,提高了48%。第三,为了实现对启动子P_(JD15)的精细调控以及减轻泄漏表达,将启动子P_(JD15)和木糖操纵子相结合,设计了由细胞密度和木糖共同诱导的杂合启动子P_(srfA)xylO~m。为了扩展其调控范围,结合由IPTG诱导的杂合启动子P_(grac)lacO,构建了分层动态调控系统,并借助蛋白酶降解过程的SspB连接蛋白和ssrA标签,实现单一层级的自我调控和双层级间的转换调控。第四,以3-羟基丁酮的耐受性为检验指标,研究损伤修复基因(mutL、alkA、mutS和mutH)的缺失和重组修复基因(recA、ssbA、bstG、polY1)的过表达对B.subtilis 168在适应性进化中突变频率的影响。结果表明,双基因mutL、alkA敲除菌株B.subtilis HS114和双基因ssbA、bstG过表达菌株B.subtilis HS119突变频率较B.subtilis 168分别提高了14.6倍和26.5倍。因此,选择mutL和alkA作为高保真模块(HFM),选择ssbA和bstG作为突变模块(MUM)。最后,将HFM和MUM与分层动态调控系统相结合,借助启动子P_(grac)lacO调控HFM和P_(srfA)xylO~m调控MUM,构建自主进化突变系统(AEMS)。3.自主进化突变系统(AEMS)的应用。首先,将AEMS应用于适应性进化筛选3-羟基丁酮耐受性表型,以60 g·L~(-1) 3-羟基丁酮作为筛选压力,细胞存活率作为筛选指标,正突变率达到了44.8%,获得最优耐受性突变株HS013。其次,将AEMS应用于适应性进化筛选3-羟基丁酮高产菌株。在HS013中过表达3-羟基丁酮生物合成路径上的三个关键酶——6-磷酸果糖激酶(PFKA)、α-乙酰乳酸合成酶(ALS)和α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC),获得重组菌株B.subtilis HS014。在此基础上,利用AEMS对HS014进行适应性进化,以3-羟基丁酮产量作为筛选指标,筛选获得最优突变株B.subtilis HS016,3-羟基丁酮产量达到64.5 g·L~(-1)。再次在HS016中,进一步过表达正向调控3-羟基丁酮合成的转录调控子CcpA和AlsR,并利用AEMS进行自主进化,筛选获得3-羟基丁酮高产菌株B.subtilis HS019,3-羟基丁酮产量达到76.3 g·L~(-1)。最后,在5-L发酵罐中对突变株HS019进行分批补料培养,3-羟基丁酮的产量、产率和生产强度分别为69.2 g·L~(-1)、0.39 g·g~(-1)和1.33 g·(L·h)~(-1)。另外,将HS019进行30-L发酵罐的扩大培养,3-羟基丁酮的产量、产率和生产强度分别达到82.5 g·L~(-1),0.46 g·g~(-1)和1.59 g·(L·h)~(-1),与5-L发酵罐水平相比,分别增加了19.2%,17.5%和19.3%。
【图文】：

羟基丁酮,结构式

1-1 3-羟基丁酮的结构式-1 Chemical structure of aceto 种平台化学品之一，，根据于一般认为安全的（GRA、香草、核桃、朗姆酒、，3-羟基丁酮通常用于烘域中的应用外，3-羟基丁基丁酮沸点适中（148oC一种中性非离子化合物化妆品，肥皂，乳液等的用于合成杂环化合物 2,3,5

羟基丁酮

的比例发生一定程度的提高，NAD生成能力下降，从而影响细胞的能。目前，为减轻辅因子循环失衡引起的负面影响，多数研究选择采用X 来催化多余的 NADH 转化为 NAD+，维持微生物的正常生长于代酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为宿主菌株，在删除了五个乙醇DH2、ADH3、ADH4、ADH5）和两个甘油 3-磷酸脱氢酶（GPD1、过过表达来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的成水 NADH 氧化再生，成功地缓解了葡萄糖发酵生产 3-羟基丁酮的过程中出现的辅因株 JHY617-SDN 在分批补料发酵中生产 3-羟基丁酮 100.1 g·L-1，产率ang 等利用代谢工程策略调控 NADH 水平，在四个候选酶中成功地筛化酶 YODC，在已经敲除 bdhA 基因的 B. subtilis 中适度表达 YOD配到 3-羟基丁酮，使得 3-羟基丁酮的产量提高至 56.7 g·L-1，增加了醇、乳酸和乙醇的生成量分别减少了 92.3%、70.1%和 75.0%，并且发倍[13]。综合上述案例，在引入 3-羟基丁酮合成路径和阻断 3-羟基丁酮径的同时，引入 NADH 氧化酶能够很好的解决大部分微生物在生产中还原力过剩的问题，从而改善菌株生长并提高 3-羟基丁酮产量。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TQ929

【参考文献】