大鲵蛙病毒LAMP检测方法的建立与应用
发布时间：2024-03-25 03:30
大鲵(Andrias davidianus Blanchard)俗名“娃娃鱼”,属于两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科、大鲵属,是我国现存最大的也是最珍稀的物种,并被列为国家II类重点保护野生动物。我国在上个世纪70年代对大鲵进行驯养和繁殖试验,随着大鲵人工繁殖的成功,大鲵养殖在陕西、四川、湖南、重庆、甘肃等省市快速发展,并逐步成为优势特色产业。大鲵蛙病毒(Chinese Giant Salamander Ranavirus, CGSRV)是近些年来发现的一种严重危害大鲵养殖的新型病原微生物,它感染大鲵主要表现为体表出现溃疡及大量的出血斑点,头部与四肢出现肿胀,有时形成溃疡灶,被人们称为“溃疡病或大脚病”,一旦发病,很难治愈,死亡率高,甚至高达100%,故被养殖户们称为“大鲵的癌症”。本研究建立了大鲵蛙病毒的LAMP检测方法,以期为CGSRV的早期、快速、特异性诊断及该病的预警提供技术保障。根据GenBank中登录大鲵蛙病毒MCP基因序列(登录号：HQ684746),利用LAMP引物设计网站(primerExplorerV4 (http://primerexplorer.jp/e/)设计4条特异...
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
1. 文献综述
1.1 大鲵病害研究概况
1.1.1 大鲵养殖现状
1.1.2 大鲵常见疾病
1.2 蛙病毒概述
1.2.1 蛙病毒的生物学性状
1.2.2 蛙病毒感染的分布与危害
1.2.3 蛙病毒感染的感染机制
1.2.4 蛙病毒感染的病理学变化
1.2.5 蛙病毒感染的诊断与防治
1.3 环介导的核酸等温扩增(LAMP)检测技术
1.3.1 LAMP技术
1.3.2 LAMP技术引物设计的基本原理
1.3.3 LAMP技术的原理
1.3.4 LAMP产物的检测
1.3.5 LAMP技术的优点
1.3.6 LAMP技术的缺点
1.3.7 LAMP技术的运用
1.4 研究目的与意义
2. 材料
2.1 病毒来源
2.2 主要试剂与耗材
2.3 主要试剂配制方法
3 试验方法
3.1 大鲵蛙病毒LAMP技术引物设计
3.2 大鲵蛙病毒的细胞培养
3.3 大鲵蛙病毒总基因组DNA的提取
3.4 大鲵蛙病毒普通PCR和巢氏PCR引物的设计
3.5 大鲵蛙病毒巢氏PCR的扩增
3.6 构建目标序列质粒
3.6.1 PCR扩增片段的胶回收、连接、转化和鉴定
3.6.2 E.coli DH5 α感受态细胞的制备
3.6.3 重组质粒的连接
3.6.4 E.coli DH5 α感受态细胞的转化
3.6.5 重组质粒阳性克隆的筛选
3.6.6 重组质粒的提取和鉴定
3.7 CGSRV LAMP扩增体系及条件优化
3.7.1 LAMP反应体系中Tm值的优化
3.7.2 LAMP反应体系中反应时间的优化
3.7.3 LAMP反应体系中Mg2+浓度的优化
3.7.4 LAMP反应体系中dNTPs浓度的优化
3.7.5 LAMP反应体系中引物浓度的优化
3.7.6 LAMP反应体系中Bst DNA聚合酶浓度的优化
3.8 LAMP检测方法特异性的检测
3.9 LAMP检测方法灵敏度的检测
3.10 不同加热方式对LAMP试验的影响
3.11 LAMP在快速检测大鲵蛙病毒中的运用
4 实验结果
4.1 大鲵蛙病毒的细胞培养
4.2 大鲵蛙病毒巢氏PCR的扩增
4.3 PCR鉴定与序列测定
4.4 CGSRV LAMP扩增体系及条件优化
4.4.1 LAMP反应体系中Tm值的优化
4.4.2 LAMP反应体系中反应时间的优化
4.4.3 LAMP反应体系中Mg2+浓度的优化
4.4.4 LAMP反应体系中dNTPs浓度的优化
4.4.5 LAMP反应体系中引物浓度的优化
4.4.6 LAMP反应体系中Bst DNA聚合酶浓度的优化
4.5 LAMP检测方法特异性的检测
4.6 LAMP检测方法灵敏度的检测
4.7 不同加热方式对LAMP试验的影响
4.8 LAMP在快速检测大鲵蛙病毒中的运用
5 讨论
5.1 大鲵蛙病毒的危害与诊断
5.2 LAMP检测方法的优势与运用
5.3 LAMP检测方法的假阳性问题
5.4 LAMP检测方法的影响因素
5.4.1 LAMP引物
5.4.2 LAMP反应中Mg2+浓度和温度的影响
6. 结论
参考文献
致谢
作者攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3938468
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
1. 文献综述
1.1 大鲵病害研究概况
1.1.1 大鲵养殖现状
1.1.2 大鲵常见疾病
1.2 蛙病毒概述
1.2.1 蛙病毒的生物学性状
1.2.2 蛙病毒感染的分布与危害
1.2.3 蛙病毒感染的感染机制
1.2.4 蛙病毒感染的病理学变化
1.2.5 蛙病毒感染的诊断与防治
1.3 环介导的核酸等温扩增(LAMP)检测技术
1.3.1 LAMP技术
1.3.2 LAMP技术引物设计的基本原理
1.3.3 LAMP技术的原理
1.3.4 LAMP产物的检测
1.3.5 LAMP技术的优点
1.3.6 LAMP技术的缺点
1.3.7 LAMP技术的运用
1.4 研究目的与意义
2. 材料
2.1 病毒来源
2.2 主要试剂与耗材
2.3 主要试剂配制方法
3 试验方法
3.1 大鲵蛙病毒LAMP技术引物设计
3.2 大鲵蛙病毒的细胞培养
3.3 大鲵蛙病毒总基因组DNA的提取
3.4 大鲵蛙病毒普通PCR和巢氏PCR引物的设计
3.5 大鲵蛙病毒巢氏PCR的扩增
3.6 构建目标序列质粒
3.6.1 PCR扩增片段的胶回收、连接、转化和鉴定
3.6.2 E.coli DH5 α感受态细胞的制备
3.6.3 重组质粒的连接
3.6.4 E.coli DH5 α感受态细胞的转化
3.6.5 重组质粒阳性克隆的筛选
3.6.6 重组质粒的提取和鉴定
3.7 CGSRV LAMP扩增体系及条件优化
3.7.1 LAMP反应体系中Tm值的优化
3.7.2 LAMP反应体系中反应时间的优化
3.7.3 LAMP反应体系中Mg2+浓度的优化
3.7.4 LAMP反应体系中dNTPs浓度的优化
3.7.5 LAMP反应体系中引物浓度的优化
3.7.6 LAMP反应体系中Bst DNA聚合酶浓度的优化
3.8 LAMP检测方法特异性的检测
3.9 LAMP检测方法灵敏度的检测
3.10 不同加热方式对LAMP试验的影响
3.11 LAMP在快速检测大鲵蛙病毒中的运用
4 实验结果
4.1 大鲵蛙病毒的细胞培养
4.2 大鲵蛙病毒巢氏PCR的扩增
4.3 PCR鉴定与序列测定
4.4 CGSRV LAMP扩增体系及条件优化
4.4.1 LAMP反应体系中Tm值的优化
4.4.2 LAMP反应体系中反应时间的优化
4.4.3 LAMP反应体系中Mg2+浓度的优化
4.4.4 LAMP反应体系中dNTPs浓度的优化
4.4.5 LAMP反应体系中引物浓度的优化
4.4.6 LAMP反应体系中Bst DNA聚合酶浓度的优化
4.5 LAMP检测方法特异性的检测
4.6 LAMP检测方法灵敏度的检测
4.7 不同加热方式对LAMP试验的影响
4.8 LAMP在快速检测大鲵蛙病毒中的运用
5 讨论
5.1 大鲵蛙病毒的危害与诊断
5.2 LAMP检测方法的优势与运用
5.3 LAMP检测方法的假阳性问题
5.4 LAMP检测方法的影响因素
5.4.1 LAMP引物
5.4.2 LAMP反应中Mg2+浓度和温度的影响
6. 结论
参考文献
致谢
作者攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：3938468
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3938468.html