草鱼在低氧胁迫下鳃的差异蛋白质组学及热休克诱导草鱼四倍体育种研究

发布时间：2020-03-31 11:07

【摘要】：草鱼(Ctenopharyngodon idella)具有快速生长,肉质肥嫩鲜美,肌间刺少等优点,在中国作为主要的淡水鱼养殖种类之一。在实际养殖过程中,因水体中的溶解氧浓度变动大,极易造成鱼类缺氧泛塘,给养殖户造成巨大的经济损失,而目前对于低氧对鱼类成体应急反应分子机制方面的研究还十分有限。鳃作为鱼类的主要呼吸器官,在参与新陈代谢和渗透调节方面具有重要的功能,同时也是对低氧环境最为敏感的器官,低氧胁迫后鳃中很多功能基因表达会发生改变。多倍体育种技术属于染色体组工程(Genome engineering)的研究领域,四倍体草鱼不仅可以自我繁殖,还能够与二倍体草鱼杂交,快速、高效的获得三倍体草鱼,三倍体草鱼在生长速度、抗逆性以及群体产量等方面均具有明显的优势,这为鱼类遗传育种的研究开创了一种新型方法。本论文具体包括以下三方面:(一)为建立并优化草鱼鳃蛋白质组双向电泳的技术体系,实验将草鱼鳃经裂解处理后,通过固相pH梯度胶条进行一向等电聚焦和SDS聚丙烯胺凝胶垂直电泳进行蛋白分离,对不同的裂解液配方、蛋白纯化方法、IPG胶条的分离范围、上样量和染色方法等进行了探索和优化,并应用lmageMaster2D Platinum7.0软件对电泳图谱进行了分析。结果表明:采用裂解液中添加DTT来取代Tris和TBP、选择分离范围为pH4-7的IPG胶条和150μg的主动水化上样,电泳结束后对凝胶进行硝酸银染色,获得了覆盖范围广、低背景、高分辨率、适合差异蛋白分析的双向电泳参考图谱。本研究为后续进行草鱼低氧胁迫下鳃的差异蛋白质组学研究提供技术支持。(二)为探索草鱼鳃应答低氧胁迫的适应性及分子机制,并寻找起关键作用的蛋白质信息;本研究测定了草鱼的LOE并且观察了鳃组织结构变化,采用双向电泳(2-DE)结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术对草鱼鳃组织在低氧胁迫下差异蛋白质进行鉴定和功能分析研究。电泳图谱经lmageMaster2D Platinum7.0软件分析,低氧胁迫组获得了372±11个蛋白点,对照组获得了406±14个蛋白点,从中筛选出15个经低氧胁迫后,表达量呈显著变化的蛋白点。对15个差异蛋白点进行质谱鉴定及数据库搜索比对。结果显示:低氧胁迫后,草鱼鳃组织中的Toll样受体4、环氧化物水解酶1、异柠檬酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、GTP结合核蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白表达显著上调,而角蛋白Ⅱ型细胞骨架8、细胞角蛋白I型、肌动蛋白相关蛋白3同源物、甲状腺激素受体TRαA、线粒体ATP合酶β亚基、柠檬酸合酶、原肌球蛋白2、原肌球蛋白3蛋白表达显著下调。其中发现6个蛋白质在低氧诱导因子1信号通路中存在。结果表明草鱼鳃组织在应答低氧胁迫时涉及到能量产生、代谢、细胞结构、抗氧化、免疫、信号转导等过程,这有助于了解鱼类在应对低氧胁迫时在蛋白质水平的分子反应机制。(三)为确认热休克诱导草鱼四倍体实际生产的可行性,本研究在实验室探索出的诱导草鱼四倍体胚胎孵化期存活率相对较高的热休克条件基础上对受精卵进行处理,具体方法如下:孵化温度21±1℃时,胚胎受精后40min、42min、51min时,分别采用41°C和42°C的热休克温度处理2min。孵出的鱼苗放入大塘养殖,冬季时对热休克诱导的草鱼进行倍性检测分析其DNA相对含量。结果表明,热休克诱导只获得二倍体和三倍体草鱼,没有得到四倍体草鱼,三倍体草鱼DNA相对含量约为正常二倍体草鱼DNA相对含量的1.5倍多。本研究采用热休克法诱导处理草鱼受精卵,可以获得一定比例的三倍体草鱼,但总体比例不高,并且四倍体草鱼至今仍无法获得,可以看出热休克的方法对于草鱼四倍体的实际生产操作技术难度大,后续在进行草鱼多倍体育种研究时可以探寻新的方案,尝试其他多倍体育种的方法。
【图文】：

裂解液,图谱,蛋白,双向电泳

上海海洋大学硕士学位论文有效的蛋白纯化方法可以显著提高双向电泳图谱的质量，本实验使用上述优化所得的裂解液配方Ⅱ，，对丙酮沉淀法和2D clean-up试剂盒法二种纯化方式对双向电泳图谱的影响进行比较。从图2-1-a中可以看出，丙酮法纯化蛋白质所得的双向电泳图谱在偏中性区域内存在一定的蛋白质丢失且横条纹稍多，蛋白点较少。利用ImageMaster2D Platinum软件分析图像可获得286个蛋白点。2D clean-up试剂盒法纯化蛋白质所得的双向电泳图谱上（图2-1-b），蛋白点覆盖范围广且分辨率高，在酸性端和中性端的蛋白点数量均有所增加，利用软件分析获得了418个蛋白点，相比于丙酮法增加了132个蛋白点，蛋白点分离明显且恢复量较大。

蛋白纯化,图谱,方法,蛋白

有效的蛋白纯化方法可以显著提高双向电泳图谱的质量，本实验使用上述优化所得的裂解液配方Ⅱ，对丙酮沉淀法和2D clean-up试剂盒法二种纯化方式对双向电泳图谱的影响进行比较。从图2-1-a中可以看出，丙酮法纯化蛋白质所得的双向电泳图谱在偏中性区域内存在一定的蛋白质丢失且横条纹稍多，蛋白点较少。利用ImageMaster2D Platinum软件分析图像可获得286个蛋白点。2D clean-up试剂盒法纯化蛋白质所得的双向电泳图谱上（图2-1-b），蛋白点覆盖范围广且分辨率高，在酸性端和中性端的蛋白点数量均有所增加，利用软件分析获得了418个蛋白点，相比于丙酮法增加了132个蛋白点，蛋白点分离明显且恢复量较大。图 1-1 不同裂解液配方所得 2-DE 图谱（a）裂解液Ⅰ；（b）裂解液ⅡFig.1-1 The 2-DE map of protein samples dissolved by different lysis buffer(a) lysis bufferⅠ;(b) lysis bufferⅡ图 2-1 不同?
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

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