双生病毒在烟粉虱中肠细胞中的运输机制研究

发布时间：2024-02-26 14:08

　　烟粉虱Bemisiatabaci属半翅目粉虱科,是一个包含至少36个隐存种的物种复合群。烟粉虱主要通过传播双生病毒对田间作物造成危害,其中包括番茄黄曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)等。烟粉虱的暴发通常伴随着双生病毒病的流行。烟粉虱以循环型方式传播双生病毒,传播过程中病毒需要经过烟粉虱的肠道、血淋巴以及唾液腺,最终随唾液一起被分泌至植物中。在传播过程中,病毒需要穿过肠道以及唾液腺的上皮细胞,这对病毒的传播至关重要。目前对于病毒跨上皮细胞运输的研究主要集中在黄症病毒科病毒中,而且研究方法也局限于透射电镜的观察。病毒在中肠上皮细胞的运输机制还有待进一步研究,例如昆虫细胞内的何种结构、哪些基因帮助病毒完成跨细胞运输?这种运输方式是否适用于其他循环型传播的病毒?为了回答这些问题,我们对双生病毒在烟粉虱中肠细胞内的运输过程进行了详细的研究,研究结果如下:(1)双生病毒在中肠上皮细胞中的运输依赖于囊泡结构。囊泡结构是一类被磷脂双分子膜包裹的亚细胞结构,主要...

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致谢
摘要
Abstract
1 文献综述及研究目的
    1.1 烟粉虱
    1.2 双生病毒
        1.2.1 双生病毒的基因组结构
        1.2.2 菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)
        1.2.3 Begomovirus的危害
    1.3 烟粉虱传播双生病毒过程
        1.3.1 媒介昆虫传播植物病毒的机制
        1.3.2 烟粉虱传播双生病毒的机制
        1.3.3 烟粉虱中肠对双生病毒传播的影响
        1.3.4 烟粉虱血淋巴对双生病毒传播的影响
        1.3.5 烟粉虱唾液腺对双生病毒传播的影响
    1.4 内体以及其他囊泡运输系统
        1.4.1 细胞内体简介
        1.4.2 早期内体
        1.4.3 晚期内体
        1.4.4 溶酶体
        1.4.5 内体的酸化
        1.4.6 内体在烟粉虱-双生病毒中的研究现状
    1.5 泛素化通路
        1.5.1 泛素以及泛素化概述
        1.5.2 泛素化过程以及所需要的蛋白
        1.5.3 泛素化的方式
        1.5.4 泛素化修饰的作用
        1.5.5 泛素化在病毒与细胞互作中的研究
    1.6 具有血淋巴毒性的抗虫蛋白
        1.6.1 影响蛋白毒性的因素
        1.6.2 将毒蛋白运送至血淋巴的方法
    1.7 本研究的目的及意义
        1.7.1 研究目的
        1.7.2 主要内容
2 基本材料与方法
    2.1 供试材料
        2.1.1 供试昆虫
        2.1.2 供试植物
        2.1.3 供试病毒
    2.2 主要仪器和试剂
        2.2.1 烟粉虱饲养及生态实验
        2.2.2 成像仪器
        2.2.3 分子生物学相关仪器
        2.2.4 分子生物学以及其他试剂
    2.3 常用实验技术
        2.3.1 DNA提取方法
        2.3.2 RNA提取方法以及反转录
        2.3.3 分子亚克隆
        2.3.4 双链RNA合成
        2.3.5 蛋白质原核表达及蛋白纯化
        2.3.6 蛋白质电泳与western blot
        2.3.7 定量PCR
        2.3.8 烟粉虱在植物上的适合度检测
3 双生病毒在烟粉虱中肠上皮细胞中的运输过程
    3.1 材料与方法
        3.1.1 供试材料
        3.1.2 化学抑制剂饲喂
        3.1.3 双链RNA合成
        3.1.4 显微注射dsRNA诱导RNA沉默
        3.1.5 沉默效率检测
        3.1.6 烟粉虱获毒能力检测
        3.1.7 烟粉虱蜜露中的糖分检测
        3.1.8 烟粉虱传毒能力检测
        3.1.9 免疫荧光
        3.1.10 共聚焦显微镜拍摄
        3.1.11 STORM显微拍摄
        3.1.12 凝集素亲和捕捉及质谱测序
    3.2 结果与分析
        3.2.1 沉默囊泡运输相关基因抑制烟粉虱获取TYLCV
        3.2.2 Brefeldin A抑制烟粉虱获取TYLCV
        3.2.3 TYLCV在烟粉虱中肠中的亚细胞定位
        3.2.4 高尔基体不参与TYLCV细胞内运输
        3.2.5 TYLCV可能位于内体或溶酶体中
        3.2.6 早期内体在TYLCV运输过程中起重要作用
        3.2.7 对病毒及囊泡结构的超高分辨成像
        3.2.8 Snx蛋白家族对烟粉虱获取病毒的影响
        3.2.9 早期内体对其他双生病毒的传播同样起重要作用
    3.3 讨论
4 泛素-蛋白酶体通路对烟粉虱传毒的影响
    4.1 材料与方法
        4.1.1 供试材料
        4.1.2 蛋白浓度测定
        4.1.3 双生病毒对烟粉虱体内泛素化的影响
        4.1.4 抑制剂饲喂对烟粉虱获取病毒的影响
        4.1.5 蛋白酶体对烟粉虱获取病毒的影响
        4.1.6 通过western bolt及免疫荧光检测CP及泛素蛋白
    4.2 结果
        4.2.1 双生病毒不影响烟粉虱体内泛素化以及蛋白酶体降解的整体活性
        4.2.2 抑制蛋白酶体活性导致烟粉虱体内病毒含量升高
        4.2.3 泛素-蛋白酶体系统可能不直接参与TYLCV的降解
    4.3 讨论
5 利用病毒外壳与毒肽融合蛋白开发杀虫毒蛋白
    5.1 材料与方法
        5.1.1 供试材料
        5.1.2 蛋白原核表达
        5.1.3 蛋白浓度测定
        5.1.4 显微注射毒蛋白
        5.1.5 蛋白膜饲喂毒蛋白
        5.1.6 转基因番茄的获得及对烟粉虱的影响
    5.2 结果
        5.2.1 蛋白表达及浓度测定
        5.2.2 注射GST-Hv1a蛋白对烟粉虱的影响
        5.2.3 GST-CP-Hv1a的经口毒性
        5.2.4 CP-Hv1a转基因番茄对烟粉虱的影响
    5.3 讨论
6 总讨论
    6.1 全文总结
    6.2 本研究的特色和创新之处
    6.3 不足之处以及值得继续研究的问题
参考文献
附录Ⅰ烟粉虱适应烟草过程的转录组分析
    1 材料与方法
        1.1 供试材料
        1.2 烟粉虱对烟草植物的长期适应
        1.3 测序样品准备
        1.4 基因表达分析
        1.5 定量验证
        1.6 GO富集分析
        1.7 烟粉虱飞行肌的图像分析
        1.8 烟草腺毛对烟粉虱的影响
        1.9 统计分析方法
    2 结果
        2.1 烟粉虱可以逐渐适应烟草寄主
        2.2 烟粉虱转录组测序及分析
        2.3 基因表达量分析
        2.4 GO富集分析
        2.5 烟粉虱体型以及飞行肌分析
        2.6 烟草腺毛对烟粉虱的影响
        2.7 烟粉虱内共生菌基因表达量变化
    3 讨论
    附录参考文献
附录Ⅱ 本文所用病毒缩写及中英文对照
附录Ⅲ 常用缓冲液及培养基配方



本文编号：3911487