美国白蛾中肠氨肽酶N的鉴定及其在Cry1Ab35蛋白杀虫机制中功能研究

发布时间：2024-01-03 17:45

　　美国白蛾Hyphantria cunea(Drury)属鳞翅目(Lepidoptera)灯蛾科(Arctiidae)昆虫,是一种重要的世界性检疫害虫,也是我国重大入侵害虫之一。由于其寄主范围广、繁殖能力强和传播速度快等特点,对我国森林资源、农林业生产和生态建设造成了严重损失。据国家林业局2018年第3、4号公告显示,我国美国白蛾疫区已涉及全国11个省(区、市)的572个县级行政区。苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前研究最成熟、应用最广泛的杀虫微生物,具有特异性强、环境友好和使用便捷等诸多优点,已经成功用于多种重要农林业害虫的防治,但用于美国白蛾防治的报道却相对较少。本研究对本实验室保存的15株Bt野生菌株进行生物活性测定,筛选出5株对美国白蛾具有高效杀虫活性的Bt菌株,分别为G31、GS24、GS31、GS36和GS70。该5株Bt菌株对美国白蛾一龄3 d幼虫的LC₅₀(50%Lethal concentration)值为0.084⁰.268 mg/mL胞晶混合物,其中GS36菌株杀虫活性最高,LC

【文章页数】：120 页

【学位级别】：博士

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摘要
abstract
1 引言
    1.1 美国白蛾简介
        1.1.1 美国白蛾发生与为害状况
        1.1.2 美国白蛾防治现状
    1.2 苏云金杆菌及杀虫蛋白概述
        1.2.1 苏云金杆菌Bt概况
        1.2.2 Bt杀虫蛋白种类
        1.2.3 Bt杀虫晶体蛋白的进化
        1.2.4 Bt杀虫晶体蛋白的结构与功能
        1.2.5 Bt杀虫晶体蛋白作用机制
        1.2.6 Bt杀虫蛋白增效途径
    1.3 Bt杀虫蛋白在昆虫中肠受体
        1.3.1 氨肽酶N(AminopeptidaseN,APN)
        1.3.2 钙粘蛋白(Cadherin,CAD)
        1.3.3 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)
        1.3.4 ABC转运体(ATP-binding cassette transporter,ABC)
        1.3.5 其它受体蛋白
    1.4 本研究的目的和意义
2 对美国白蛾高效活性Bt菌株的筛选
    2.1 实验材料
        2.1.1 供试昆虫
        2.1.2 供试菌株
        2.1.3 培养基
        2.1.4 主要溶液及试剂
        2.1.5 主要仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 Bt菌株对美国白蛾杀虫活性测定
        2.2.2 Bt菌株晶体形态观察
        2.2.3 Bt菌株cry基因型鉴定
        2.2.4 Bt菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 Bt菌株对美国白蛾杀虫活性测定
        2.3.2 Bt菌株晶体形态观察
        2.3.3 Bt菌株cry基因型鉴定
        2.3.4 Bt菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析
    2.4 讨论
    2.5 小结
3 对美国白蛾高效Cry1Ab35蛋白的表达及活性分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 供试昆虫
        3.1.2 菌株及质粒
        3.1.3 培养基
        3.1.4 主要溶液及试剂
        3.1.5 主要仪器设备
    3.2 实验方法
        3.2.1 Bt菌株质粒的提取
        3.2.2 cry1Ab35基因的克隆与原核表达
        3.2.3 Bt工程菌HD1Ab35的构建
        3.2.4 Bt工程菌HD1Ab35晶体蛋白提取
        3.2.5 Cry1Ab35蛋白浓度的测定
        3.2.6 Cry1Ab35蛋白抗体的制备
        3.2.7 Cry1Ab35蛋白杀虫活性测定
    3.3 结果与分析
        3.3.1 cry1Ab35基因的克隆与序列分析
        3.3.2 cry1Ab35基因的原核表达
        3.3.3 工程菌HD1Ab35的构建及鉴定
        3.3.4 工程菌HD1Ab35晶体蛋白形态观察
        3.3.5 工程菌HD1Ab35晶体蛋白的表达及定量
        3.3.6 Cry1Ab35蛋白杀虫活性测定
    3.4 讨论
    3.5 小结
4 Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性增效因子
    4.1 实验材料
        4.1.1 供试昆虫
        4.1.2 菌株及质粒
        4.1.3 昆虫病毒
        4.1.4 主要溶液及试剂
        4.1.5 主要仪器设备
    4.2 实验方法
        4.2.1 TnGV的增殖、提取与纯化
        4.2.2 TnGV Enhancin蛋白的制备
        4.2.3 Bt GS36菌株enhancin-like基因的克隆
        4.2.4 Enhancin-like蛋白的原核表达
        4.2.5 Enhancin-like蛋白的提取与纯化
        4.2.6 三种增效因子在Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性中的增效作用分析
    4.3 结果与分析
        4.3.1 TnGV Enhancin蛋白的检测
        4.3.2 enhancin-like基因的克隆及序列分析
        4.3.3 enhancin-like基因的原核表达
        4.3.5 三种增效因子在Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性中的增效作用
    4.4 讨论
    4.5 小结
5 美国白蛾中肠Cry1Ab35蛋白结合蛋白的鉴定
    5.1 实验材料
        5.1.1 供试昆虫
        5.1.2 菌株及质粒
        5.1.3 主要溶液及试剂
        5.1.4 主要仪器设备
    5.2 实验方法
        5.2.1 Cry1Ab35蛋白的活化
        5.2.2 美国白蛾中肠BBMV蛋白的提取
        5.2.3 Ligandblot检测Cry1Ab35蛋白结合蛋白
        5.2.4 Cry1Ab35蛋白结合蛋白LC-MS/MS分析
        5.2.5 美国白蛾幼虫及组织样本制备
        5.2.6 美国白蛾总RNA的提取及cDNA合成
        5.2.7 hcapns基因的克隆与序列分析
        5.2.8 hcapns基因时空表达分析
        5.2.9 饲喂美国白蛾幼虫Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表达分析
    5.3 结果与分析
        5.3.1 Cry1Ab35蛋白的活化
        5.3.2 美国白蛾中肠BBMV蛋白的检测
        5.3.3 Cry1Ab35蛋白美国白蛾中肠BBMV结合蛋白的鉴定
        5.3.4 美国白蛾中肠Cry1Ab35蛋白结合蛋白质谱分析
        5.3.5 hcapns基因的克隆
        5.3.6 hcapns基因序列分析
        5.3.7 hcapns基因时空表达分析
        5.3.8 饲喂美国白蛾幼虫Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表达水平分析
    5.4 讨论
    5.5 小结
6 美国白蛾HcAPNs蛋白的表达及功能分析
    6.1 实验材料
        6.1.1 供试昆虫
        6.1.2 菌株及质粒
        6.1.3 培养基及试剂
        6.1.4 主要仪器设备
    6.2 实验方法
        6.2.1 重组HcAPNs蛋白在昆虫细胞系Sf9中的表达
        6.2.2 重组HcAPNs蛋白与Cry1Ab35蛋白结合分析
        6.2.3 hcapns基因RNAi及功能分析
    6.3 结果与分析
        6.3.1 重组Bacmid-hcapns的构建
        6.3.2 重组HcAPNs蛋白在昆虫细胞系Sf9中的表达
        6.3.3 重组HcAPNs蛋白与Cry1Ab35蛋白结合分析
        6.3.4 dsRNA的合成及检测
        6.3.5 注射美国白蛾幼虫dsRNA-hcapns后hcapns基因表达水平检测
        6.3.6 注射dsRNA-hcapns美国白蛾幼虫对Cry1Ab35蛋白敏感性测定
    6.4 讨论
    6.5 小结
全文结论
本研究创新点
参考文献
在读期间已发表论文
作者简历
致谢



本文编号：3876539