桑树响应植原体侵染的甲基化差异基因的鉴定及其功能研究

发布时间：2020-04-02 03:00

【摘要】：DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰方式是植物响应逆境胁迫的一种重要分子机制,有研究表明植原体侵染影响植物DNA甲基化动态的调控,但植物在响应植原体侵染过程中DNA甲基化的变化和调控机制还不清楚。本研究以健康和黄化型萎缩病发病(感病)桑树叶片为研究对象,采用转录组测序和甲基化修饰依赖性内切酶测序(Methylation-dependent restriction-site associated DNA sequencing,Methyl RAD-Seq)技术,对桑树在响应植原体侵染过程中转录组和基因组DNA甲基化水平变化进行了联合分析,筛选出了DNA甲基化调控的差异表达基因,并对其功能进行了研究,初步阐明DNA甲基化在桑树响应植原体侵染过程中对基因表达的调控作用。具体研究结果如下:(1)桑树响应植原体侵染过程中的转录组分析成功构建了感病桑树与健康桑树叶片的转录组测序文库,并进行了高通量测序分析,鉴定得到2 722个差异表达基因,其中在感病叶片中上调的有1 701个,下调的1 021个。利用KEGG Pathway分析,差异表达基因被富集到154条代谢通路,主要包括代谢、激素合成、信号传导等代谢调控通路。(2)桑树响应植原体侵染过程中基因组DNA甲基化差异分析利用Methyl RAD-Seq技术对感病与健康桑树叶片基因组的DNA甲基化水平进行分析,共鉴定得到34 595个甲基化位点,有5 042个甲基化位点在感病与健康桑树基因组中存在差异,其中有3 676个CCGG甲基化差异位点,在感病桑树叶片中甲基化水平升高的CCGG位点有1 990个,甲基化水平降低的位点有1 686个,由935个基因被检测到包含CCGG甲基化差异位点;另外还鉴定得到1 366个CCNGG甲基化差异位点,其中在感病桑树叶片中甲基化水平升高的位点818个,甲基化水平降低的位点548个,由347个基因被检测到包含CCNGG甲基化差异位点。(3)桑树响应植原体侵染过程中的DNA甲基化水平与基因表达水平的关联分析将筛选出的DNA甲基化差异基因和mRNA差异表达基因进行关联分析,发现有55个基因的表达水平与甲基化水平均存在显著差异,这些差异表达基因中包括了45个CCGG甲基化位点和10个CCNGG甲基化位点,有35个基因在感病桑树中甲基化水平与转录水平变化趋势一致,有20个呈现相反的变化趋势。DNA甲基化程度和基因表达丰度都存在差异的基因包括6个抗病相关基因,以及多种与植物代谢、信号传导、转录调控等相关的基因。通过定量PCR技术和CHOP-PCR技术分别对差异表达基因的mRNA表达丰度和DNA甲基化水平进行了验证,证明了高通量测序结果的可靠性。(4)筛选出的与植物抗病性相关的候选基因的功能分析根据联合分析的结果,选出了与抗病相关的两个差异表达基因抗病蛋白基因(Mul-RPM1)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因(Mul-STK),对其生物功能进行了分析。利用PCR技术分别克隆得到了Mul-RPM1和Mul-STK基因,亚细胞定位分析发现Mul-RPM1和Mul-STK均定位在质膜区域。Mul-RPM1和Mul-STK基因的表达均受到水杨酸和桑树病原菌的诱导,DNA甲基化水平也受病原菌侵染影响,但其DNA甲基化水平不受水杨酸处理的影响。分别构建两基因的植物表达载体,转化拟南芥,筛选获得其转基因植株,发现两基因在拟南芥中超表达都可提高转基因植株对Pst.DC3000抗性。因此,桑树Mul-RPM1和Mul-STK甲基化水平的变化可能影响两基因的表达,对植物的抗病性具有调控作用。以上研究结果有助于深入研究桑树Mul-RPM1和Mul-STK基因的功能及其表达调控机制,为从DNA甲基化修饰水平上揭示桑树黄化型萎缩病的发生机制奠定基础。
【图文】：

序列,功能注释,转录本,维恩图

图；X 轴表示碱基长度范围；Y 轴表示在该长度区域的 Uniibution map; X axis represents base length range; Y axis represents uni图 3-1 转录本长度分布图Figure 3-1 Length distribution map of transcripts注释转录组序列与七大功能数据库比对，在 Nr、Swiss别注释到 28 820、21 219、6 185、16 279、18 44945.97%、13.40%、35.27%、39.97%，在各数据库见图 3-2。

分布图,分布图,数目,表达水平

换后的平均表达水平），Y 轴代表 M 值（log2 转换后的差异倍数alue A and the Y axis represents value M. Gray represents non-DEG.图 3-5 差异基因的 MA-plot 分布图Figure 3-5 MA-plot distribution map of differential genes下降，Y 轴代表差异基因数目。红色代表上调的差异基因数目，，
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S888

【参考文献】