柑橘溃疡病的LAMP快速检测及生物防治初步研究

发布时间：2020-03-31 01:11

【摘要】：柑橘溃疡病(Citrus canker)是柑橘生产上重要的病害,对世界柑橘产业造成巨大经济损失;该病是由植物病原细菌柑橘黄单胞菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.citri)侵染后引起的病害。病菌的早期和准确诊断,对柑橘溃疡病的防治至关重要。早期开发了细菌分离、抗体免疫反应和聚合酶链反应等病菌检测方法,但是,这些方法存在耗时、费力和需要昂贵的实验仪器。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型等温 DNA 扩增技术,其特点是时间短、特异性强、灵敏度高和不需要专用的实验室仪器。已有研究表明,LAMP可用于基层的植物检验检疫中对疑似患病样品进行快速和准确鉴定。本研究根据柑橘溃疡病菌公布的一段特异的保守核苷酸序列,设计了 6条LAMP引物,并建立了柑橘溃疡病菌的LAMP检测方法。利用LAMP检测方法可以对柑橘溃疡病菌的基因组DNA和柑橘溃疡病病斑基因组DNA进行特异扩增,而对非靶标菌基因组DNA不发生扩增,特异性与普通PCR结果一致。该LAMP检测方法最低可检出100 pg的柑橘溃疡病菌基因组DNA,和最低每微升4个细菌,灵敏度均比PCR高了 1250倍。LAMP检测法能很好地区分症状极易混淆的柑橘溃疡病和疮痂病。因此,我们认为本研究建立的柑橘溃疡病菌LAMP检测方法具有简单、快速、灵敏和特异等优点,可用于田间样品的快速检测。疫区柑橘溃疡病的防治主要以化学喷雾防治,但是由于化学防治存在环境污染和抗药性产生,生物防治是替代的防治措施。本研究为了探明壳聚糖和生防芽孢杆菌对柑橘溃疡病的防治潜力,本研究采用平板菌落计数法评价了 3种粘度壳聚糖对柑橘溃疡病菌的抑菌效果,改良的纸碟法测定了 2株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵液对柑橘溃疡病菌的抑菌效果。综合处理0.5h、3h和6h的结果显示,3种粘度壳聚糖对柑橘溃疡病的杀菌强弱依次为:粘度12粘度100粘度20。枯草芽孢杆菌菌株BS101和54-6芽孢杆菌在YPG培养基中有氧发酵3天产生发酵液产生的抑菌圈直径分别为3.45 cm和3.21 cm,比0.1 g/ml氨苄青霉素的抑菌圈分别大45%和35%。据此推测两株芽孢细菌的发酵液中存在对溃疡病菌有抗菌活性的化学物质。因此,粘度12的壳聚糖和芽孢杆菌菌株BS 101和54-6在田间具有防治柑橘溃疡病的潜力。
【图文】：

柑橘溃疡病,侵染循环,温度范围,柑橘属

蛾幼虫（户办／／0￡７＾０邋ａ７ｒｅ／／ａ）通过叶片的取食形成伤口有利于病原菌的侵染，逡逑加剧溃疡病的发生，田间表现抗病的柑橘属品种及栽培变种也会表现出高度感病逡逑性（图１．１）。逡逑－２－逡逑

特异性,柑橘溃疡病

作为阳性对照。结果表明，本研宄成功建立了柑橘溃疡病菌的ＬＡＭＰ检测体系，逡逑所设计的引物特异性扩增柑橘溃疡病菌的基因组ＤＮＡ，，不能对其它供试细菌的逡逑基因组ＤＮＡ进行特异性扩增（图３．１Ａ和图３．１Ｃ）。ＬＡＭＰ对柑橘溃疡病菌的逡逑基因组ＤＮＡ产生扩增，产生特征性的梯状条带，。如所示，常规ＰＣＲ对柑橘溃逡逑疡病菌的基因组ＤＮＡ产生扩增，扩增产物大小为１６１邋ｂｐ邋（图３．１Ｂ）同样具有特逡逑异性。本研宄建立的ＬＡＭＰ法与常规ＰＣＲ法一样，同样可用于柑橘溃疡病菌的逡逑快速检测。逡逑与常规ＰＣＲ法相比，ＬＡＭＰ法得到的扩增产物还可以利用ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ染逡逑料进行染色用于肉眼观察。ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ邋Ｉ是一种核酸染料，可以结合所有的逡逑ｄｓＤＮＡ，与ｄｓＤＮＡ结合后荧光大大增强。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ染料加到ＬＡＭＰ的扩增逡逑产物中，可以通过颜色变化判断是否发生了扩增。ＬＡＭＰ扩增前加入ＳＹＢＲ邋Ｇｒｅｅｎ逡逑Ｉ反应液呈现橙红色
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.66;S476

【参考文献】