不同培养条件对口腔细菌生物膜生长的影响

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临床口腔医学杂志2006 年 6 月第 22 卷第 6 期

J Clin St omatol, Jun, 2006, V ol. 22, N o. 6

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基础研究

不同培养条件对口腔细菌生物膜生长的影响*
赵 今 * * * , 朱 日丙, 李继遥, 周学东 * * , 肖晓蓉

( 四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室 四川 成都
[ 摘要]

610041)

目的: 研 究 5 种口 腔细菌在体外形成生物膜的能力、 形成过程及 不同培养 条件对生物 膜形成的影 响,

并通过激光共聚焦扫描显微镜( CL SM ) 观察细 菌生物 膜的形 成及结 构特征。方 法: 选择与 龋病发生 关系密 切的 5 种口腔细菌, 分别接种在含牛心脑浸液培养基( BHI ) 、 人工唾液( BM 5) 以及人唾液培 养基的标准 96 孔板中, 在培养 6 h、 h、 h、 h、 h、 h 和 60 h 后取出相应 的微孔板, 11% Cryst al V iolet 染色 生物膜, 95% 乙 醇复吸 Cr ystal 8 12 24 36 48 V iolet, HT S7000PL U S 多孔板高效分析仪测定各 时段细 菌生物 膜的生长 情况, 并绘 制生 长曲线。 CL SM 观察 细菌 生物膜形成的结构变化。结果: 在 BHI 及 BM 5 中 5 种口腔细菌均能形成生物膜, 在人唾液中 没有形成 生物膜。细 菌生物膜形成表现为缓慢的非线性生长, 出现了一个相对的生长停滞期, 这个时期出现在 36~ 48 h 之间, 不同细菌 略有差别。激光共聚焦扫描显微镜( CL SM ) 观察发现在培养 6 h 后仅 有少量 细菌粘附 形成散 在微菌 落, 24 h 后出 现生物膜的基本结构, 48 h 形成成 熟的生物膜。结论: 研究发 现在体外 细菌形 成生物 膜的能 力与培 养基条 件密切 相关, 细菌生物膜形成缓慢, 其间有一个相对生长停滞期 。细菌定 植, 粘附, 共集聚是生物膜形成的重要步骤。 [ 关键词] 细菌生物膜; 培养条件; 微孔板; 激光共聚焦扫描显微镜 R780. 2 [ 文献标识码] A [ 文章编号] 1003- 1634( 2006) 06- 0323- 03 [ 中图分类号]

Study of five cariogenic bacteria biofilm formation in vitro Chengdu 610041, China

ZH A O Jin, ZH U Bing , LI Ji-y ao , ZH O U X ue -

dong, XI A O X iao ong . K ey Lab. Of Or al Biomedical Engineer ing of M inistry of Education, Sichuan University , -r [ Abstract] Objective: T his research was to standardize a polyv iny l chlor ide ( P VC) micro titer plate assay to compare the ability of 5 cariogenic bacteria to form biofilms and to explore its character istic, ultra structure, and influences by dif ferent medium. Method: A total of 5 car iogenic bacteria strains were grow n in three differ ent medium included BHI, BM 5 and saliva medium in P VC micro iter plate wells. Biofilm formation was indirectly assessed by staining w ith 1% cr ystal -t violet and measuring cr ystal violet absorbance, using distaining solution. T he biofilm growth curves of 5 laboratory strains were made. T he ultrastructures of bioilm were observed under Co focal Laser Scanning M icrosco pe ( CLSM ) . Result: 5 car iogenic bacteria strains formed biofilm structur e in BH I and BM 5 medium, but in saliva medium no biofilm were ob served. T he developmental step in bio film formation include initial attachment to a surface, the for matio n of micro colonies and an mature bio film structur e. Conclusion: T he ability of car iogenic bacteria to form biofilm was influenced by different strains and cultur e medium. T he necessary steps of biofilm formation include init ial attachment, the formation of micro co lonies and co ag gregation. [ K ey words] biofilm; Differ ent medium; M icr o titer plate assay; CL SM -

龋病是一种慢性细菌性疾病, 现代龋病病因学认 为, 牙菌斑是典型的生物膜结构, 是龋病发生的始动因 子。口腔中牙菌斑生物膜是由多种微生物在牙面上沉 积的有机基质中互相集聚、 交联而形成的生态结构, 生 物膜中各种微生物相互依存, 相互竞争, 构成了复杂的 生态关系。大量研究表明, 生物膜细菌与浮游细菌在 生长代谢, 致病性, 对药物的敏感性等方面都有显著差
* 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 30430800) * * 通讯作者: 周学东 Tel : 028- 85501439 * * * 赵今现在新疆医科大学口腔系

异。细菌生物膜对宿主防御系统有较强的抵抗力, 耐 受性强, 对抗生素敏感性下降, 具有空间和环境的多样 性, 能表达不同于浮游细菌的表型。本研究目的是在 体外探索一种简单和高效的细菌生物膜形成的方法, 了解口腔细菌在体外形成生物膜的能力、 形成过程及 不同培养条件对生物膜形成的影响, 并通过激光共聚 焦扫描显微镜( CL SM ) 观察细菌生物膜的形成及结构 特征, 为进一步研究口腔细菌生物膜的药物敏感实验 奠定方法学基础。

324 材料和方法
1. 实 验 菌 株及 菌 悬 液 制 备

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物膜的形成情况并绘制生长曲线。 5. 激光共聚焦扫描显微镜观察不 同培养 条件下 细菌生 物 膜形成及结构 用于细胞培养直径 15 mm 无菌盖 玻片放入 24 孔细胞培养皿中, 每孔加入 细菌悬液 500 L , 培养基 1500 L, 每种细菌分 3 种不同培养基条件: BHI、 5 及 人唾液 培养基, BM 每组培养基 2 个平 行样, 重 复 3 次实验, 以 不加 菌悬液 培养 的 玻片为背景对照。分别于 6 h、 h、 h 和 48 h 取 出相应的玻 12 24 片, PBS 洗玻片 2 次去除 表面浮游细菌, 室温 下暗箱中 Fluores cein( 荧光黄 10 mg / L ) 染 色孵育 80 min, 蒸 馏水洗 玻片 2 次 去 除残留染液。染色的生物膜标本于 CLSM 下观察, 观察条件 为 氩激光( 514/ 488 nm) , He N e 激光( 534 nm) , 物镜 像。 6. 统计学处理 采用 SPSS10. 0 软 件进 行分析, 运 用单 因 素方差分析法比较判断组间差别, 用 T urkey 法进行两两比较。 20, 扫描 图

变 形 链 球 菌 Streptococcus

mutans( S. mutans) AT CC 25175、 血链球菌 Streptococcus sang uis ( S. sanguis) AT CC 10556、 氏 放 线 菌 Actinomy ces naeslundii 芮 ( A. naeslundii) WU V 627、 粘性放线菌 A ctinomyces viscosus( A. v iscosus ) AT CC 19246、 酸 杆 菌 L actobacillus r hamnosus( L. 乳 r hamnosus ) AC 413 由口腔生物医学工程教育部重 点实验室微 生物室提供 。将复苏 48 h 的 菌种接 种于 BHI 液体 培养 基中, 80% N2 , 20% CO 2, 37 下厌氧培 养 18 h( A. naeslundii 和 A. 10
8

v iscosus 培养 24 h) , 涂片检查为纯培养后比浊仪测 细菌悬液浓 度, 用 P BS 缓 冲 液 将 细 菌 悬 液 调 1. 0 M cFarland ( 3. 0 CFU / mL) 。 2. 培 养基 选取 3 种培 养基: 牛心脑 浸液培 养基( BHI ) 、 15 min 再过 滤 除菌。 人工唾液( BM 5) 及人唾液。人唾 液由健康 捐献者提供, 收集 捐 献者上午非刺激 性全 唾液, 4000 r/ min BH I 和 BM 5 培养基所用 原料中水解酪蛋白、 胃黏膜 蛋白、 猪 胰 蛋白胨为美国 Sigma 公司 产 品, 其 余均 为 北京 化 工试 剂 厂 生 产。 3. 主要试剂设 备 标准 96 孔微量板( Corning Incorpor ated L, CostorR 3599 ) , Cr ystalT M Spec( tm) 比浊仪( 美国 Becton Dickinson and Company ) , 排 枪 ( T ransferpetterR 8 30 ~ 300 BRAN D 德国) , HT S 7000 PL U S 型多孔板( 荧光/ 紫外光) 高 效 分析仪( 美国 PERK IN ELM ER) , 激光共聚焦扫描显微镜( Leica T SCSP2 德国 ) 1% Cr ystal V iolet( w t/ vol) ( Sigma, 美 国) , Fluo rescein C 20H 12O 5( 上 海三爱思试剂有限公司) 。 4. 不同培养条件对细菌生物膜生 长影响 和生长 曲线测 定 取细菌悬液 50 L 加入含 有不 同培 养基 150 L/ 孔的 96 孔 板, 细菌分 3 种不 同培 养基 培养: BHI、 5 和 人唾 液培 养基。 BM 80% N 2, 20% CO 2, 37 下厌氧 培养, 实验过程 中每 12 h 更 换 新鲜培养基 150 L/ 孔, 每种培养基 做 4 个平 行孔, 重复 3 次 实 验, 以不含菌悬液的孔作为基数对照。分别在 6 h、 h、 h、 8 12 24 h、 h、 h 和 60 h 取出 相应的 96 孔板。吸 出孔 内菌 悬液, 36 48 PBS 洗孔 2~ 3 次去除浮游细菌, 微孔 板在室温下 干燥 30 min, 加入 1% Crystal V iolet 200 L/ 孔, 放 置 20 min 后吸 出 染液, PBS 洗孔 2~ 3 次去除孔壁染液, 孔板在室温下干燥 30 min , 加 入 95% 乙醇 200 L / 孔微量震荡器上震荡 30 min 复吸染液, 复 吸液放入一新的 96 孔微量板中, HT S 7000 P LU S 型多孔板( 荧 光/ 紫外光) 高效分析仪分 别测定 OD570, 记 录各 时间段 细菌 生

结

果

1. 在不 同培养基条件下细 菌生 物膜的 生长 情况见 图 1~ 3, 用 HT S7000 分析仪 570 nm 可见光测定细 菌生物膜 时发现, 在体外细菌形成生物膜需要一定的培养条件。3 种不同培养基 条件下, 5 种口腔细 菌在 BHI 和 BM 5 培 养基 中均 能形 成细 菌 生物膜, 而在人唾液培养 条件 下未能 测到 变化的 OD 值。图 1 是以变形链球菌为例根据各时段测定的不同培养基 条件下 O D 值绘制的细菌生物膜生 长曲 线。图 2 是在 同样 的培养 条件 下 ( 以 BHI 培养基为例) 5 种细菌的 生物膜生长 曲线, 观察到细 菌 生物膜形成表现为缓慢的非线性生长, 出现了一 个相对的生 长 停滞期, 这个时期出 现在 36~ 48 h 之间 , 不同 细菌 略有 差别。 图 3 观察到 不同细菌形成生物膜的能力不 同, 对 培养基的选 择 也有一定差异。统计学比 较发现, 各 细菌 在 BHI 和 BM 5 培 养 基中形成生物膜的能力无显著性 差异( P > 0. 05) , 与 人唾液 培 养条件下相 比有显著 性差 异( P < 0. 05) 。在 同样 的培 养条 件 下, 5 种细菌形成生物膜的能力无显著性差异( P > 0. 05) 。 2. CL SM 观 察细 菌 生 物 膜 生 长, 实 验 观 察 到 在 BHI 和 BM 5 培 养基中 5 种细菌生物膜各时段的结构变化过程, 但在 人 唾液培养基中各 细菌 没有 形成 生 物膜 结构。图 4~ 7 是 以 S. mutans 为例在 BHI 培 养条件下 6 h, 12 h, 24 h 和 48 h 各时 段 的生物膜形态。可见体外 细菌 生物膜 的形 成需 经历细 菌定 植 ( 见图 4) , 彼此间粘附成团( 见 图 5) , 形 成细菌 微菌落 ( 见 图 6) 到成熟生物膜结构( 见图 7) 一系 列过程。在本实验中 5 种细菌 形成生物膜都经历了以上过程, 只是在时间上 略有差别。

图1

在不 同培养 基中 S . mut ans 生 物膜生 长曲线

图 2 同一培养条件不同细菌生物 膜生长曲 线

图 3 5 种实验细菌在不同培养基中 48 h 生 物膜生长情况

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图 4 6 h S. mutans 生物膜结构 CLSM 物镜( 20)

图5

12 h S. mut ans 生 物膜 结 构 CLS M 物镜( 20)

图6

24 h S . mut ans 生物 膜结 构 CLSM 物镜( 20)

图7

48 h S . mut ans 生物 膜 结 构 CLSM 物镜( 20)

讨

论

培养基条件, 结果发现无糖的培养基、 缺少 CAA( 酪蛋 白水解后产生的氨基酸) 以及托 黑氏肉汤不产生生物 膜, 大部分的糖类均有利于细菌生物膜的生长。本实 验使用了 3 种不同的培养基, 结果发现 BH I 和 BM5 有利于细菌生物膜的形成, BHI 是一种营养丰富的培 养基, 内含有一定量的葡萄糖, 人工唾液中的猪胃黏膜 蛋白对生物膜的生长有重要影响[ 10] 。理论上人唾液 应有利于细菌生物膜的形成, 但实验中由于收集的唾 液难以消毒, 采用高速离心加滤菌处理, 这一过程可能 影响了唾液的成分。有研究[ 9] 发现直接 从人体收集 的唾液经滤菌处理后只有放线菌能形成生物膜, 但加 入葡萄糖后链球菌就能形成生物膜, 由此可见, 糖和蛋 白质在细菌生物膜形成中发挥着重要的作用。本研究 仅局限于单菌种生物膜, 对多菌种生物膜有待进一部 研究。 [参 考 文 献]
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研究细菌生物膜的方法有两大类, 即定性研究和 定量研究。定性研究主要目的是了解细菌生物膜形成 过程及生物膜形态结构, 主要用不同的显微镜作为研 究仪器, CLSM 用于细菌生物膜观察, 克服了其它显微 镜的缺点, 做到原位, 实时, 动态地观察细菌生物膜结 构[ 1] 。定量研究 又有半定 量和定量 之分。半 定量研 究方法是将附着于材料表面的生物膜作为一个整体进 行测量, 可见光及普通 荧光测量法即属 此类方法
[ 2]

。

本实验目的主要是观察细菌生物膜形成的条件, 过程 及形态结构变化, 尚未进行生物膜生长代谢和生理特 性的研究, 因此选择半定量的 570 nm 可见光测定和 CL SM 的研究方法。 实验发现用微孔板测定分析细菌 生物膜的形成是一种简单、 效、 高 重复性 好的研究方 法。 细菌生物膜形成过程研究较早, 但直到 CLSM 出 现, 生物膜的形成和形态才比较完整地被观察到。本 实验观察到 5 种口腔细菌在形成生物膜的过程中各有 其特点, 而且都经历了几个相同的过程: 细菌定植于 载体表面, 6 h 仅有少量散 在的细菌菌落定植于载体 表面( 图 4) 。有相关研究表明, 在这一时期细菌会产 生一定的化学物质使细菌 的表型发生改变 [ 3] 。 细 菌间彼此粘附成团, 散在的细菌很难抵抗环境的变化, 细胞间的粘附使细菌能适应环境的变化。相互粘附的 细菌间存在一定的孔隙( 见图 5、 , 这些孔隙作为营 6) 养通道, 排泄通道, 同时为彼此交换代谢产物创造交通 条件
[ 4]

。

成熟细菌生物膜的形成( 见图 7) , 细菌生
[ 5]

物膜在形成过程中产生大 量的胞外多糖( EPS) , EPS 是成熟 细菌生 物膜结 构的基 础 细菌耐受外力及干燥环境等
[ 8]

, 发 挥着 重要 的作
[ 6、 7]

用, 聚集营养, 阻滞药物进入 细菌生物膜内部 。

,使

细菌在 体外形 成生物 膜需要 一定的 培养 条件, Loo CY 等[ 9] 在链球菌生物膜的体外实验中提供各种

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