家蚕蛹表达人生长激素蛋白及其生物活性的研究

发布时间：2016-09-04 11:01

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《浙江大学》 2009年

家蚕蛹表达人生长激素蛋白及其生物活性的研究

蓝航莲  

【摘要】：人生长激素(hGH)是由人垂体前叶细胞分泌的一种多肽类激素,对机体的组织、器官以及各种代谢活动都起着重要的生理功能。本试验首先构建了重组质粒pET28a—hGH,经终浓度为1 mM IPTG在大肠杆菌中诱导带rhGH融合蛋白的表达,融合蛋白带有His_6标签;纯化得到无生物活性的融合蛋白作为抗原免疫雄性新西兰大白兔,收集抗血清后采用硫酸铵沉淀方法纯化多克隆抗体;抗血清的效价为1:25600;Western blot结果显示多克隆抗体存在较高的特异性,以rhGH为抗原制得的抗体也可以和hGH蛋白发生特异性结合反应。高效抗—hGH多克隆抗体的制备为下游的工作奠定了基础。 昆虫杆状病毒是与原核、酵母以及哺乳动物细胞系统并存的表达外源蛋白的一类重要表达系统,因其可以高效表达有活性的外源蛋白而被广泛应用。家蚕杆状病毒表达系统是昆虫杆状病毒的重要组成部分,本试验利用该系统在受体家蚕细胞和蚕蛹中合成hGH。利用共转染技术携带有hGH基因的重组转移质粒pBacPAK—hGH与线性化的BmBacPAK6基因组DNA在家蚕细胞中发生同源重组,产生有插入hGH基因的重组家蚕杆状病毒;利用空斑分析以及lac—Z基因的蓝白筛选纯化重组病毒vBmhGH,并通过Southern杂交验证重组病毒基因组中的hGH基因。TCID50检测重组病毒的滴度为6.0×10~8 PFU/ml;家蚕细胞感染vBmhGH表达rhGH,最大表达量为约52μg/10~6细胞;家蚕蛹感染vBmhGH,在血淋巴中检测到rhGH,并且感染病毒120 h后rhGH的合成达到最大值约300μg/蛹;制取感染vBmhGH的蚕蛹血淋巴,利用凝胶层析、IP以及RPC的方法分离纯化rhGH,结果从1 ml血淋巴中可以分离得到约180μg rhGH;进一步的体外细胞试验表明,蚕蛹表达的rhGH可以促进K562细胞的集落形成;对去垂体大鼠进行灌喂给药,结果rhGH不仅可以促进大鼠体重的增加,也可以促进肝脏以及胫骨的生长,表明蚕蛹表达的hGH具有体内生物活性。同时研制的hGH口服胶囊经动物急性毒性和长期毒性试验等临床前研究表明,hGH口服胶囊无明显的急性毒性,长期服用hGH口服胶囊无明显的毒副作用。因此家蚕蛹表达的rhGH有望在将来成为一种潜在的口服给药治疗呆小症和阿尔茨海默氏病等hGH缺乏相关疾病的潜在蛋白类药物。hGH口服胶囊的动物抗氧化试验和果蝇寿命延长试验表明,其可以显著降低心脏脂褐素含量和提高肝脏SOD比活力,延长果蝇平均寿命。因此我们研制的hGH口服胶囊具有延缓衰老的功效,是一种潜在的口服给药抗衰老蛋白类药物。利用蚕蛹高效表达有生物活性的rhGH为拓展hGH的应用领域,开发基于hGH的药品和保健品打下了良好的基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：Q78
【目录】：

缩略词(Abbreviation)8-10

中文摘要10-12

Abstracts12-14

第一章 文献综述和试验设计14-47

第一节 人生长激素(hGH)研究进展14-28

1.hGH的结构14-16

2.hGH的生理功能16-19

3.hGH的制备、提纯19-21

4.hGH的测定方法21-22

5.hGH的临床应用22-28

第二节 家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统研究进展28-36

1.杆状病毒表达系统的建立及其原理28-29

2.杆状病毒载体表达系统的改进29-33

3.杆状病毒载体表达系统的特点33-34

4.家蚕/BmNPV系统相对于Sf细胞/AcNPV系统的优势34-36

第三节 试验设计方案36-38

1.试验目的和意义36

2.本研究的主要内容36-37

3.试验流程图37-38

参考文献38-47

第二章 hGH融合蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备47-71

1.材料与方法47-62

1.1 材料、试剂及仪器47-53

1.2 实验方法53-62

2.结果与讨论62-69

2.1 重组质粒pET28a—hGH的构建62-64

2.2 E.coli疗中重组蛋白rhGH的诱导表达64-66

2.3 rhGH重组蛋白的纯化66-67

2.4 兔抗rhGH抗血清的效价测定67-68

2.5 纯化多克隆抗体的特异性鉴定68-69

3.结论69-70

参考文献:70-71

第三章 重组家蚕杆状病毒vBmhGH的构建及纯化71-94

1.材料与方法72-84

1.1 材料72-74

1.2 方法74-84

2.结果与讨论84-91

2.1 重组质粒pBacPAK—hGH的鉴定84-85

2.2 家蚕杆状病毒Bm-BacPAK_6基因组DNA的线性化85-86

2.3 共转染及重组病毒的纯化86-88

2.4 重组病毒的鉴定88-89

2.5 重组病毒滴度的测定89-91

3.结论91-92

参考文献92-94

第四章 rhGH在家蚕细胞以及蚕蛹中的表达94-110

1.材料与方法94-100

1.1 材料94-95

1.2 方法95-100

2.结果与讨论100-108

2.1 hGH标准曲线绘制100

2.2 rhGH在家蚕细胞中的合成100-102

2.3 rhGH基因在蚕蛹中的表达102-105

2.4 rhGH的纯化105-108

3.结论108-109

参考文献109-110

第五章 蚕蛹表达rhGH的生物活性研究110-127

1.材料与方法110-115

1.1 材料110-111

1.2 方法111-115

2.结果与讨论115-123

2.1 rhGH促人红白血病细胞克隆形成115-116

2.2 去垂体大鼠的体重增加试验116-117

2.3 去垂体大鼠的肝重增加以及胫骨试验117-118

2.4 hGH口服胶囊小鼠抗氧化实验结果118-119

2.5 hGH口服胶囊果蝇生存期实验结果119

2.6 hGH口服胶囊NIH小鼠和SD大鼠急性毒性试验结果119

2.7 hGH口服胶囊SD大鼠长期毒性试验结果119-123

3.结论123-125

参考文献125-127

致谢127

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