hsa c irc 0 006602/miR-224/Rac1调节轴对骨肉瘤细胞的增殖和侵袭的影响

发布时间：2024-04-08 20:40

　　研究背景骨肉瘤属于原发于骨质的恶性肿瘤的一种,好发于青少年人群,死亡率高。尽管采取手术,辅助化疗和放疗等治疗策略,但骨肉瘤病人的5年生存率仍很低。因此,寻找参与肿瘤发展的新分子可以为骨肉瘤患者的诊治提供新策略。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类产生于RNA前体的反向剪接过程的不含5’端帽和3’ polyA尾结构的RNA。多种生命体中均可检测到稳定存在的circRNAs,并可通过miRNA调控下游mRNA表达,在癌症进展中发挥着重要作用,已成为当前的研究热点。Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1),属于RHO GTPases家族成员,研究报道其在多种恶性肿瘤中普遍上调,且Rac1的激活与肿瘤增殖和转移密切相关。我们前期预实验发现,hsa-circ₀006602在骨肉瘤癌组织中表达上调,并可能通过circRNA-miRNA-mRNA网络调控参与骨肉瘤的进展。本课题拟通过实验研究探讨hsa_circ₀006602/miR-224/Rac1调控轴对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。研究目的本实验拟对骨肉瘤组织...

【文章页数】：90 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
1 引言
2 材料
    2.1 组织
    2.2 细胞株和菌株
    2.3 动物来源
    2.4 质粒载体
    2.5 引物
    2.6 主要试剂耗材
    2.7 主要仪器设备
    2.8 主要实验试剂配制
        2.8.1 配置细胞完全培养基
        2.8.2 琼脂糖凝胶制备
        2.8.3 配置磷酸盐缓冲溶液
        2.8.4 配置0.25%EDTA胰蛋白酶
        2.8.5 配置冻存液
        2.8.6 配置TBST缓冲液
        2.8.7 5×转膜缓冲液的配置
        2.8.8 5×电泳缓冲液的配置
        2.8.9 配置封闭液
        2.8.10 溶解miR-224 mimics、miR-224 inhibitor、hsa_circ₀006602 siRNA与NC
        2.8.11 配置LB液体培养基
        2.8.12 配置LB固体培养基
        2.8.13 配置过硫酸铵溶液
3 实验方法
    3.1 实时荧光定量PCR检测骨肉瘤癌组织及其癌旁组织中hsa_circ₀006602、Rac1 mRNA和miR-224的表达水平
        3.1.1 提取骨肉瘤癌组织及其癌旁组织中总RNA
        3.1.2 hsa_circ₀006602与Rac1的cDNA合成与qRT-PCR反应
        3.1.3 miR-224的cDNA合成与qRT-PCR反应
    3.2 细胞操作方法
        3.2.1 细胞复苏
        3.2.2 细胞培养条件
        3.2.3 细胞传代
        3.2.4 细胞冻存
    3.3 测序鉴定hsa_circ₀006602在骨肉瘤细胞中存在
        3.3.1 提取细胞中总RNA
        3.3.2 逆转录为cDNA
        3.3.3 人基因组DNA提取
        3.3.4 PCR扩增
        3.3.5 琼脂糖凝胶回收DNA片段
        3.3.6 T载体连接
        3.3.7 转化
        3.3.8 蓝白斑筛选
    3.4 实时定量PCR检测骨肉瘤细胞与正常成骨细胞中hsa_circ₀006602、Rac1 mRNA和miR-224的表达水平
        3.4.1 提取细胞中总RNA
        3.4.2 逆转录为cDNA
        3.4.3 细胞的实时定量PCR反应
    3.5 免疫印记检测Rac1在骨肉瘤癌组织及其癌旁组织中的表达
        3.5.1 骨肉瘤组织总蛋白的提取
        3.5.2 配置SDS-PAGE胶
        3.5.3 免疫印迹实验步骤
    3.6 免疫印记检测骨肉瘤细胞与hFOB1.19细胞中蛋白表达
        3.6.1 细胞中总蛋白的提取
        3.6.2 SDS-PAGE胶
        3.6.3 免疫印记实验
    3.7 MG63细胞转染
        3.7.1 细胞的转染
        3.7.2 实时定量PCR检测细胞转染效率
        3.7.3 转染所用RNA序列
    3.8 CCK-8检测细胞活性
    3.9 Transwell实验检测细胞侵袭
    3.10 检测细胞迁移(划痕实验)
    3.11 生物信息学预测
    3.12 双荧光素酶报告实验测定结合
        3.12.1 提取基因组DNA
        3.12.2 hsa_circ₀006602与Rac1野生型和突变型载体构建
        3.12.3 双荧光素酶报告实验
    3.13 hsa_circ₀006602 siRNA稳定转染细胞株获得与筛选
        3.13.1 筛选浓度确定
        3.13.2 hsa_circ₀006602 siRNA稳转株鉴定
    3.14 裸鼠成瘤实验
    3.15 统计学分析
4 实验结果
    4.1 骨肉瘤中hsa_circ₀006602的筛选与结构鉴定
        4.1.1 hsa_circ₀006602的环化过程
        4.1.2 hsa_circ₀006602的结构鉴定
    4.2 骨肉瘤及癌旁组织中hsa_circ₀006602、miR-224和Rac1的表达
    4.3 骨肉瘤细胞系和正常人成骨细胞系hFOB1.19中hsa_circ₀006602、miR-224和Rac1的表达
    4.4 敲低hsa_circ₀006602对MG63细胞中hsa_circ₀006602、miR-224、Rac1的表达及增殖、侵袭、迁移能力的影响
    4.5 构建裸鼠移植瘤模型检测hsa_circ₀006602对骨肉瘤细胞皮下成瘤能力影响
    4.6 生物信息学分析hsa_circ₀006602、miR-224和Rac1间关联
    4.7 双荧光素酶报告实验检测hsa_circ₀006602、miR-224和Rac1间匹配结合作用
        4.7.1 重组载体构建
        4.7.2 双荧光素酶报告实验结果
    4.8 转染miR-224 mimics可致MG63细胞中Rac1表达下调
    4.9 回复实验验证在骨肉瘤细胞中存在hsa_circ₀006602/miR-224/Rac1网络调节骨肉瘤的增殖、侵袭和迁移
5 讨论
6 结论
7 参考文献
综述 circRNA的形成机制及与骨肉瘤的相关性研究进展
    参考文献
个人简历
致谢



本文编号：3948781