去泛素化酶USP8对缝隙连接蛋白CX43的去泛素化作用和对其功能的影响
发布时间：2024-01-30 22:46
蛋白质的泛素化修饰方式可以调控蛋白质包括降解在内的很多功能,其中包括USP8(Ubiquitin-specific protease 8,泛素特异性蛋白酶8)在内的去泛素化酶是泛素化修饰的关键调节因素之一。CX43(Connexin 43,缝隙连接蛋白43)以及主要由其承担的GJIC(gap junction intercellular communication,细胞缝隙连接通信)是细胞的基本蛋白分子和功能,对乳腺癌的转移等很多生物学行为都有重要的调控作用。泛素化是CX43降解的主要触发因素和降解途径的选择因素。因此,研究USP8对CX43的去泛素化的具体机制,以及调控其降解的方式,进而研究这种作用对于乳腺癌的转移的影响,具有重要的基础研究意义和临床应用的潜在价值。本课题主要分两部分,第一部分研究USP8对CX43的具体作用及机制。第二部分则着重研究USP8通过去泛素化对CX43功能的影响。在第一部分,我们首先通过胞内胞外免疫共沉淀实验,证实USP8和CX43直接结合。其次发现二者结合后,USP8对CX43有去泛素化作用。随后研究发现,这种去泛素化作用导致CX43的降解受到抑制。接下...
【文章页数】：90 页
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摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 蛋白质的泛素化修饰
1.1.1 泛素
1.1.2 泛素化及相关的酶
1.1.3 泛素化修饰模式的多样性及原因
1.1.4 泛素化修饰模式和功能相关性
1.2 细胞内的蛋白质降解途径和泛素化的关系
1.2.1 泛素-蛋白酶体途径
1.2.2 自噬-溶酶体途径
1.2.3 内体-溶酶体途径
1.2.4 三者的关系
1.2.4.1 内体和自噬
1.2.4.2 蛋白酶体和自噬
1.3 USP8
1.3.1 USP8 的结构
1.3.2 USP8 的一般底物及功能
1.3.2.1 EGFR 表皮生长因子受体家族
1.3.2.2 中心体和V-SNARE蛋白
1.3.2.3 趋化因子受体4
1.3.2.4 其它的底物
1.3.3 USP8 对泛素化酶的调节及相应的功能
1.3.4 USP8 对内体ESCRT组分的去泛素化作用及功能
1.3.5 USP8 对自噬的组分的去泛素化作用及相应的功能
1.3.6 USP8 的被调节
1.3.7 USP8 在肿瘤的研究
1.4 缝隙连接和CX43
1.4.1 缝隙连接及缝隙连接蛋白
1.4.2 CX43 的结构
1.4.3 CX43 的合成和调控
1.4.4 CX43 的门控通讯功能及调控
1.4.5 CX43 的非通讯功能
1.4.6 CX43 的半通道功能
1.4.7 CX43和GJ的降解和调控
1.4.7.1 CX43 合成后的降解过程和调控因素概述
1.4.7.2 泛素化酶对CX43 降解的调控研究
1.4.7.3 去泛素化酶对CX43 降解的调控研究
1.4.7.4 蛋白酶体途径
1.4.7.5 自噬和内吞溶酶体途径
1.4.8 CX43 在肿瘤的研究情况
1.4.8.1 CX43 抑制肿瘤细胞增殖
1.4.8.2 CX43 对肿瘤细胞迁移侵袭的影响
1.4.8.3 CX43 抑制肿瘤干细胞的干性
1.5 CX43 在乳腺癌的研究现状
1.5.1 在乳腺发育表达情况
1.5.2 在乳腺癌组织和细胞的表达情况
1.5.3 对增殖和凋亡的影响
1.5.4 对转移的影响
1.5.4.1 CX43 对乳腺癌转移影响的体内观察性研究
1.5.4.2 CX43 影响乳腺癌转移的细胞和分子机制
1.5.5 和乳腺癌干细胞的关系
1.5.6 半通道的作用
1.5.7 CX43/GJIC需要考虑的其它因素
1.5.8 CX43/GJIC用做治疗靶标的研究
1.6 本论文的立题依据
第二章 实验材料和方法
2.1 实验材料和仪器
2.1.1 实验细胞株
2.1.2 质粒
2.1.2.1 USP8 相关质粒
2.1.2.2 CX43 相关质粒
2.1.2.3 ubiquitin相关质粒
2.1.2.4 对照质粒
2.1.3 小鼠
2.1.4 临床标本
2.1.5 细胞培养基及细菌培养平板
2.1.6 主要实验试剂和耗材
2.1.7 主要实验实验仪器
2.1.8 常用试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 质粒的构建
2.2.2 细胞株的体外培养、传代及铺板
2.2.3 细胞化学转染
2.2.4 慢病毒感染贴壁细胞
2.2.5 蛋白质免疫印迹Western blotting
2.2.6 免疫荧光染色
2.2.7 组织固定、脱水、包埋和切片
2.2.8 HE染色
2.2.9 免疫组化IHC染色
2.2.10 BCA法测定蛋白浓度
2.2.11 蛋白表达及His-Tag蛋白纯化
2.2.12 放线菌酮(CHX)蛋白半衰期检测法
2.2.13 免疫共沉淀
2.2.14 体外泛素化
2.2.15 体内泛素化
2.2.16 荧光染料转移流式细胞检测
2.2.17 Transwell细胞迁移和侵袭实验
2.2.18 mammosphere实验
2.2.19 统计分析用spss软件
第三章 USP8对CX43 的去泛素化作用
3.1 证实USP8和CX43 在细胞内直接结合
3.2 USP8对CX43 有去泛素化作用,提高其稳定性
3.2.1 USP8对CX43 有去泛素化作用
3.2.1.1 过表达USP8致CX43 泛素化程度下降
3.2.1.1.1 体内泛素化实验
3.2.1.1.2 体外泛素化实验
3.2.1.2 敲低USP8 表达致CX43 泛素化程度上升
3.2.2 USP8对CX43 的去泛素化作用提高其蛋白含量
3.2.2.1 USP8 过表达致细胞内CX43 蛋白含量增加
3.2.2.2 USP8 敲低致细胞内CX43 蛋白含量减少
3.3 USP8 保护CX43 免受自噬介导的降解
3.3.1 CHX阻断CX43 合成后,USP8对CX43 降解的影响
3.3.1.1 MEF细胞的半衰期实验
3.3.1.2 MDA-MB-231 细胞的半衰期实验
3.3.2 蛋白降解阻滞剂探究USP8 保护CX43 免于降解的具体降解途径
3.3.2.1 在USP8 敲低MEF细胞的阻滞剂实验
3.3.2.2 在USP8 敲低MDA-MB-231 细胞的阻滞剂实验
3.3.3 BAF对 USP8 敲低细胞的CX43 降解的影响
3.3.3.1 BAF对 USP8 敲低MEF细胞的CX43 降解的影响
3.3.3.2 BAF对 USP8 敲低MDA-MB-231 细胞CX43 降解的影响
3.3.4 Atg7 敲除对的USP8 敲低MEF细胞的CX43 降解的影响
3.4 USP8 降低CX43 的多泛素化和多聚泛素化
3.4.1 K63或K48 泛素化抗体检测CX43的K63或K48 多聚泛素化
3.4.1.1 USP8 过表达时CX43的K63或K48 多聚泛素化情况
3.4.1.2 USP8 敲低CX43的K63-或K48 多聚泛素化情况
3.4.2 Ubk0 质粒研究CX43 的单泛素化、多位点单泛素化情况
3.5 临床标本连续切片的免疫组化研究
3.6 小结
第四章 USP8 通过去泛素化影响CX43 的功能
4.1 USP8 敲低致MEFs细胞GJIC削弱
4.2 USP8 敲低后乳腺癌细胞的干细胞特性的变化
4.3 USP8 敲低后乳腺癌细胞迁移的变化
4.3.1 USP8 敲低后乳腺癌细胞迁移能力的变化
4.3.2 USP8 敲低后乳腺癌细胞迁移能力变化的rescue实验
4.4 小结
第五章 全文小结
5.1 主要结论
5.2 研究展望
参考文献
附录一 缩略语
致谢
攻读博士学位期间学术和科研成果
本文编号：3890496
【文章页数】：90 页
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 蛋白质的泛素化修饰
1.1.1 泛素
1.1.2 泛素化及相关的酶
1.1.3 泛素化修饰模式的多样性及原因
1.1.4 泛素化修饰模式和功能相关性
1.2 细胞内的蛋白质降解途径和泛素化的关系
1.2.1 泛素-蛋白酶体途径
1.2.2 自噬-溶酶体途径
1.2.3 内体-溶酶体途径
1.2.4 三者的关系
1.2.4.1 内体和自噬
1.2.4.2 蛋白酶体和自噬
1.3 USP8
1.3.1 USP8 的结构
1.3.2 USP8 的一般底物及功能
1.3.2.1 EGFR 表皮生长因子受体家族
1.3.2.2 中心体和V-SNARE蛋白
1.3.2.3 趋化因子受体4
1.3.2.4 其它的底物
1.3.3 USP8 对泛素化酶的调节及相应的功能
1.3.4 USP8 对内体ESCRT组分的去泛素化作用及功能
1.3.5 USP8 对自噬的组分的去泛素化作用及相应的功能
1.3.6 USP8 的被调节
1.3.7 USP8 在肿瘤的研究
1.4 缝隙连接和CX43
1.4.1 缝隙连接及缝隙连接蛋白
1.4.2 CX43 的结构
1.4.3 CX43 的合成和调控
1.4.4 CX43 的门控通讯功能及调控
1.4.5 CX43 的非通讯功能
1.4.6 CX43 的半通道功能
1.4.7 CX43和GJ的降解和调控
1.4.7.1 CX43 合成后的降解过程和调控因素概述
1.4.7.2 泛素化酶对CX43 降解的调控研究
1.4.7.3 去泛素化酶对CX43 降解的调控研究
1.4.7.4 蛋白酶体途径
1.4.7.5 自噬和内吞溶酶体途径
1.4.8 CX43 在肿瘤的研究情况
1.4.8.1 CX43 抑制肿瘤细胞增殖
1.4.8.2 CX43 对肿瘤细胞迁移侵袭的影响
1.4.8.3 CX43 抑制肿瘤干细胞的干性
1.5 CX43 在乳腺癌的研究现状
1.5.1 在乳腺发育表达情况
1.5.2 在乳腺癌组织和细胞的表达情况
1.5.3 对增殖和凋亡的影响
1.5.4 对转移的影响
1.5.4.1 CX43 对乳腺癌转移影响的体内观察性研究
1.5.4.2 CX43 影响乳腺癌转移的细胞和分子机制
1.5.5 和乳腺癌干细胞的关系
1.5.6 半通道的作用
1.5.7 CX43/GJIC需要考虑的其它因素
1.5.8 CX43/GJIC用做治疗靶标的研究
1.6 本论文的立题依据
第二章 实验材料和方法
2.1 实验材料和仪器
2.1.1 实验细胞株
2.1.2 质粒
2.1.2.1 USP8 相关质粒
2.1.2.2 CX43 相关质粒
2.1.2.3 ubiquitin相关质粒
2.1.2.4 对照质粒
2.1.3 小鼠
2.1.4 临床标本
2.1.5 细胞培养基及细菌培养平板
2.1.6 主要实验试剂和耗材
2.1.7 主要实验实验仪器
2.1.8 常用试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 质粒的构建
2.2.2 细胞株的体外培养、传代及铺板
2.2.3 细胞化学转染
2.2.4 慢病毒感染贴壁细胞
2.2.5 蛋白质免疫印迹Western blotting
2.2.6 免疫荧光染色
2.2.7 组织固定、脱水、包埋和切片
2.2.8 HE染色
2.2.9 免疫组化IHC染色
2.2.10 BCA法测定蛋白浓度
2.2.11 蛋白表达及His-Tag蛋白纯化
2.2.12 放线菌酮(CHX)蛋白半衰期检测法
2.2.13 免疫共沉淀
2.2.14 体外泛素化
2.2.15 体内泛素化
2.2.16 荧光染料转移流式细胞检测
2.2.17 Transwell细胞迁移和侵袭实验
2.2.18 mammosphere实验
2.2.19 统计分析用spss软件
第三章 USP8对CX43 的去泛素化作用
3.1 证实USP8和CX43 在细胞内直接结合
3.2 USP8对CX43 有去泛素化作用,提高其稳定性
3.2.1 USP8对CX43 有去泛素化作用
3.2.1.1 过表达USP8致CX43 泛素化程度下降
3.2.1.1.1 体内泛素化实验
3.2.1.1.2 体外泛素化实验
3.2.1.2 敲低USP8 表达致CX43 泛素化程度上升
3.2.2 USP8对CX43 的去泛素化作用提高其蛋白含量
3.2.2.1 USP8 过表达致细胞内CX43 蛋白含量增加
3.2.2.2 USP8 敲低致细胞内CX43 蛋白含量减少
3.3 USP8 保护CX43 免受自噬介导的降解
3.3.1 CHX阻断CX43 合成后,USP8对CX43 降解的影响
3.3.1.1 MEF细胞的半衰期实验
3.3.1.2 MDA-MB-231 细胞的半衰期实验
3.3.2 蛋白降解阻滞剂探究USP8 保护CX43 免于降解的具体降解途径
3.3.2.1 在USP8 敲低MEF细胞的阻滞剂实验
3.3.2.2 在USP8 敲低MDA-MB-231 细胞的阻滞剂实验
3.3.3 BAF对 USP8 敲低细胞的CX43 降解的影响
3.3.3.1 BAF对 USP8 敲低MEF细胞的CX43 降解的影响
3.3.3.2 BAF对 USP8 敲低MDA-MB-231 细胞CX43 降解的影响
3.3.4 Atg7 敲除对的USP8 敲低MEF细胞的CX43 降解的影响
3.4 USP8 降低CX43 的多泛素化和多聚泛素化
3.4.1 K63或K48 泛素化抗体检测CX43的K63或K48 多聚泛素化
3.4.1.1 USP8 过表达时CX43的K63或K48 多聚泛素化情况
3.4.1.2 USP8 敲低CX43的K63-或K48 多聚泛素化情况
3.4.2 Ubk0 质粒研究CX43 的单泛素化、多位点单泛素化情况
3.5 临床标本连续切片的免疫组化研究
3.6 小结
第四章 USP8 通过去泛素化影响CX43 的功能
4.1 USP8 敲低致MEFs细胞GJIC削弱
4.2 USP8 敲低后乳腺癌细胞的干细胞特性的变化
4.3 USP8 敲低后乳腺癌细胞迁移的变化
4.3.1 USP8 敲低后乳腺癌细胞迁移能力的变化
4.3.2 USP8 敲低后乳腺癌细胞迁移能力变化的rescue实验
4.4 小结
第五章 全文小结
5.1 主要结论
5.2 研究展望
参考文献
附录一 缩略语
致谢
攻读博士学位期间学术和科研成果
本文编号：3890496
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