肿瘤相关成纤维细胞对肝癌细胞生物学作用及其机制研究

发布时间：2016-11-01 21:37

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《第二军医大学》 2014年

肿瘤相关成纤维细胞对肝癌细胞生物学作用及其机制研究

刘娇  

【摘要】：[研究背景及目的] 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的消化系统肿瘤之一。尽管近30年来HCC的诊断与治疗已取得了较大进展,但是其预后并未得到根本改善。因此,深入研究HCC发生、发展及其耐药机制,寻找有效的治疗靶点是研究人员亟需攻克的难题。 随着肿瘤研究不断深入,研究人员发现肿瘤细胞并不是“孤军奋战”,他们可以招募周围间质细胞形成一个新的整体,我们称之为肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)。肿瘤微环境是由肿瘤细胞、细胞外基质(extracellular matrix, ECM).多种间质细胞及其分泌的蛋白组成。间质中的细胞成分主要分为三类：血管相关细胞(angiogenic cells)、免疫细胞(immune cells)及肿瘤相关成纤维细胞(tumor associated fibroblasts,TAFs)。越来越多的研究表明TAFs参与维持肿瘤的标志性特征,如增殖信号的持续活化、抵抗细胞死亡、维持细胞持续复制、诱导血管生成、促进增殖及转移、改变能量代谢等。同时,TAFs增加肿瘤细胞对化疗药物的抵抗能力。因此,靶向TAFs阻断其对肿瘤的“支持”作用是肿瘤治疗的新策略。 基于以上研究背景,本研究主要探索TAFs对HCC发生、发展的作用。我们将从三个方面展开研究。首先,在人HCC组织中分离并纯化TAFs及癌旁成纤维细胞(peri-tumor fibroblasts,PTFs),利用细胞免疫化学及Real-time PCR检测TAFs与PTFs相关标记物的表达,研究二者生物学特性差异；在此基础上建立TAFs与肝肿瘤细胞株体外共培养系统,观察TAF对肝肿瘤细胞株增殖、侵袭、转移、成球、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)、皮下成瘤与转移等生物学效应的影响；进一步研究TAFs促进肿瘤恶性转化的机制,芯片检测并筛选TAFs与PTFs分泌差异的趋化因子,探讨趋化因子对TAFs与肝肿瘤细胞Cross-talk的作用并寻找相关信号转导通路。为HCC的临床治疗提供新的思路和方法。 [实验方法] 一、肝癌相关成纤维细胞的分离与鉴定 1.分离并纯化TAFs与PTFs 将人HCC组织与癌旁组织剪碎,胶原酶Ⅳ消化完全后梯度离心得到TAFs与PTFs,利用Anti-fibroblast磁珠纯化原代分离的成纤维细胞。 2.鉴定TAFs与PTFs 细胞免疫化学与Real-Time PCR检测TAFs与PTFs细胞α-SMA、Vimentin、FSP-1及EMT相关指标表达。 3. TAFs与PTFs生物学特性的差异 将不同TAFs与PTFs以3×103/孔的数量接种于96孔板中,每组设3个复孔,CCK-8每天检测TAFs与PTFs的增殖情况；将TAFs与PTFs消化并重悬于无血清DMEM中,以4×104/孔的数量接种于上层迁移小室,24小时后检测TAFs与PTFs的迁移情况。 二、TAFs与PTFs对肝肿瘤细胞生物学特性的影响 1.建立TAFs、PTFs与肝肿瘤细胞的共培养系统 将’TAFs与PTFs置于0.4μm共培养小室中与下层肿瘤细胞共培养或收集 TAFs与PTFs培养液上清(条件培养基Conditional medium,CM)直接培养肝肿瘤细胞。 2. TAFs对肝肿瘤细胞株增殖、侵袭及迁移能力的影响 建立TAFs与PTFs与肝肿瘤细胞的共培养系统,CCK-8检测TAFs与PTFs或其条件培养基(含3%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时)对不同肝肿瘤细胞株增殖能力的影响；将TAFs与PTFs (1×104)接种于24孔板底层,肝肿瘤细胞株LM3置于上层侵袭小室中,24小时后利用结晶紫对侵袭细胞进行染色,显微镜观察并拍照；将TAFs与PTFs细胞或条件培养基(含3%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时)置于24孔板底层,肝肿瘤细胞株接种于上层迁移小室中,24小时后利用结晶紫对迁移细胞进行染色,显微镜观察并拍照。 3. TAFs对肝肿瘤细胞株上皮-间质转化的作用 将2×105的Huh7细胞接种于35mm培养皿中,待其贴壁后更换培液为TAFs与PTFs条件培养基(含3%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时),Real-time PCR及细胞免疫荧光法检测EMT相关指标的表达。 4. TAFs对肝肿瘤细胞株“干性”的影响 TAFs与PTFs条件培养基处理(干细胞专用培养液培养成纤维细胞24小时)Huh7细胞48小时,Real-time PCR检测肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)以及自我更新相关基因在mRNA表达水平的变化；流式细胞仪分选Huh7细胞中Epcam阳性及阴性的细胞,将分选后的细胞以每孔10个细胞的数量加入低吸附的96孔板中(未分选的Huh7细胞作为对照),利用TAFs与PTFs条件培养基(干细胞专用培养液培养成纤维细胞24小时)处理细胞,7天和14天分别计数成球细胞,计算成球率。 5.TAFs对肝肿瘤细胞株成瘤及转移能力的影响 皮下成瘤实验：将TAFs与PTFs与人肝癌细胞株LM3按1：5制成混合细胞悬液(LM3:1×106,TAFs/PTFs:2×105),接种于裸鼠皮下,建立小鼠皮下成瘤模型,观察其皮下成瘤情况。 体内转移实验：将luciferase标记的Huh7细胞与TAFs/PTFs以5：1的比例制成细胞混合悬液(Huh7:1×106,TAFs/PTFs:2×105),接种于NOD-SCID小鼠皮下,建立小鼠皮下转移模型,活体成像仪观察转移情况。 三、TAF促进HCC恶性转化的机制 1.芯片检测TAFs与PTFs趋化因子表达的差异 收集三对TAFs与PTFs培养液上清(DMEM无血清培养24小时),采用Raybiotech试剂盒进行趋化因子表达谱的检测。筛选出表达差异明显的趋化因子；收集不同来源TAFs与PTFs的RNA(DMEM无血清培养24小时)验证芯片结果。 2. Real-time PCR检测芯片结果中有变化的趋化因子及其受体的表达。检测三种趋化因子(CCL2、CCL5、CXCL16)对肝肿瘤细胞株Huh7迁移能力的影响。 将趋化因子CCL2、CCL5、CXCL16以0.10、20、40ng/ml的浓度分别加入24孔板下层培养液(500μl含1%FBS的DMEM)中,在上层迁移小室中接种Huh7细胞(5×104),培养24小时后染色并拍照；收集PTFs与TAFs的条件培养基(含1%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时),将趋化因子CCL2、CCL5、CXCL16中和抗体以0.1、5μg/ml的浓度分别加入PTFs与TAFs的条件培养基中,混匀后以500μl／孔的体积加入24孔板。在上层迁移小室中接种Huh7细胞(5×104),培养24小时后染色并拍照。 3.TAFs对肝肿瘤细胞株信号转导通路的影响 Huh7细胞转染报告基因质粒(Wnt、Hippo、NF-κB、Hedgehog、TGF-β),转染后6小时将培养液更换为PTFs与TAFs的条件培养基(含1%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时),共培养24小时后检测荧光素酶表达情况。筛选出有变化的信号转导通路；将Huh7细胞(1×105)接种于35mm培养皿,贴壁后将培养液更换为PTFs与TAFs的条件培养基(含1%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时),24小时后收集RNA,Real-time PCR检测Hedgehog和TGF-β通路相关基因的表达。 4.趋化因子对Hedgehog和TGF-β信号通路的影响 Huh7细胞转染Hedgehog和TGF-β报告基因质粒,转染后6小时将培养液更换为无血清DMEM培养基,趋化因子CCL2、CCL5、CXCL16以0、5、10、20ng/ml浓度加入培养基中,检测Hedgehog和TGF-β通路的活化情况；利用PTFs与TAFs条件培养基(含1%FBS的DMEM培养成纤维细胞24小时)处理转染细胞,加入CCL2、CCL5、CXCL16中和抗体(0、1、5μg/ml),共培养24小时后,检测Hedgehog和TGF-β通路的活化情况；将Huh7细胞(1×105)接种于35mm培养皿,贴壁后利用无血清DMEM饥饿细胞12小时,趋化因子CCL2、CCL5、CXCL16以0、10、20ng/ml浓度加入培养基中,24小时后收集RNA,Real-time PCR检测Hedgehog和TGF-β通路相关基因的表达。 四、统计学处理 数据采用SPSS16.0统计软件包进行分析,结果以X±SD表示。多组间采用One-Way ANOVA分析,P0.05为统计结果具有显著性差异。[实验结果] 一、原代分离TAFs与PTFs的表型与生物学特性不同 1.细胞免疫荧光结果显示PTFs与TAFs均表达α-SMA、Vimentin与FSP-1,其中α-SMA与FSP-1在TAFs中表达明显强于PTFs。但是Vimentin在二者之间表达未见差别。 2. Real-Time PCR检测结果显示α-SMA、FAP、PDGF在TAFs中表达高于PTFs二、N-cadherin、Snail、Twist(P0.05)；EMT间质相关指标TAFs在PTFs中表达高于E-cadherin(P0.05),而上皮相关指标PTFs在 3. TAFs中表达较高(P0.05)。PTFs。 的增殖能力与迁移能力高于TAFs促进肝肿瘤细胞恶性转化 1.TAFs促进肝肿瘤细胞增殖、侵袭与迁移 (1)成纤维细胞条件培养基处理LM3与Huh7细胞,结果发现TAFs促进肿瘤细胞株增殖作用明显高于PTFs与正常对照组；另外,不同TAFs的条件培养基与Huh7细胞共培养,Huh7细胞增殖出现不同程度的增加；TAF细胞与MHCC-H、SK-Hep1、 Huh7、PLC共培养,可显著促进不同肿瘤细胞株增殖。 (2)侵袭实验结果显示,TAF细胞处理组LM3细胞的侵袭率为89.7%,高于PTFs处理组(66.3%)与对照组(39.1%)(P0.05)。 (3)迁移实验结果显示,不同来源TAFs条件培养基均可促进Huh7细胞迁移,其促迁移能力高于PTF组与对照组(P0.05)；另外,TAFs增强肝肿瘤细胞MHCC-H、 SK-Hep1、Huh7、PLC细胞的迁移能力。 2. TAFs促进肝肿瘤细胞发生上皮-间质转化 TAFs条件培养基处理Huh7细胞,Real-time PCR结果显示Huh7细胞间质代表基因N-cadherin、Snail、Twist与a-SMA表达均上调(与PTFs组相比,P0.01),而上皮代表基因E-cadherin表达下调(P0.01)。细胞免疫荧光结果显示E-cadherin与Vimentin荧光强度在对照组、PTFs与TAFs组间未见明显差别,但是Vimentin阳性细胞比例在TAFs条件培养基处理组显著增多。 3. TAFs增加肝肿瘤细胞的“干性” TAF条件培养基处理Huh7细胞,Real-time PCR结果显示CSC相关基因CD44、 CD90、CD133与Epcam表达均上调(P0.05)；此外,自我更新相关基因Sox2、 Oct4、Nanog、Klf4表达亦明显上调(P0.05)；利用流式细胞仪将Huh7细胞分为Epcam阳性与Epcam阴性两组,未分选的Huh7细胞作为对照,进行成球实验。结果显示TAFs条件培养基可以增加Epcam阳性、Epcam阴性以及未分选Huh7细胞的成球率,其中Epcam阳性细胞成球率增加最为明显,约为12%(P0.05)。而PTFs对细胞成球能力无明显影响。 4. TAFs增加肝肿瘤细胞的成瘤与转移能力 成瘤实验：TAFs组裸鼠约在第6天开始出现肿瘤,PTFs组出现肿瘤的时间在第9天；21天后处死小鼠,结果显示TAFs组肿瘤瘤重与体积均大于PTFs组,说明TAFs促进肝肿瘤细胞成瘤的能力强于PTFs。 转移实验：第七周将小鼠麻醉,腹腔注射荧光素钾,取出小鼠左侧上肢骨、肺、脾、肝、肾、脑进行荧光扫描,结果显示PTFs组5只小鼠有一只出现转移,而TAFs组7只小鼠有6只出现转移,说明TAFs可显著促进肿瘤细胞的迁移。 三、 TAFs促进HCC恶性转化的机制 1.TAFs与PTFs趋化因子表达不同 芯片检测显示,TAFs培养上清中7种趋化因子含量明显于高PTFs。Real-time PCR证实CCL2(MCP-1)、CCL5(RANTES)、CXCL16在TAFs中表达显著高于PTFs组,其余4种(CCL7、CCL11、CXCL1、CXCL8)在二者之间未见明显变化,但是相关趋化因子受体在TAFs中表达均高于PTFs。另外,TAFs与Huh7细胞共培养后,Huh7细胞中CCL2、CCL5、CXCL16相应受体CCR2、CCR5与CXCR6的表达显著升高(P0.05)。 2.趋化因子CCL2、CCL5、CXCL16促进Huh7细胞迁移 迁移实验结果显示：CXCL16促迁移作用最强,CCL2、CCL5促进迁移的能力相似,在20ng/ml浓度刺激下,迁移率约为30%(P0.001)。同时,趋化因子CCL2、 CCL5、CXCL16中和抗体可部分阻断TAFs促进Huh7迁移的作用。 3. TAFs激活肝肿瘤细胞Hedgehog和TGF-β通路 五个被检测通路TGF-β、NF-κB、Wnt、Hippo)中只有Hedgehog与TGF-β在TAFs刺激后活化,其中TAFs处理组TGF-β通路明显活化,其荧光素酶表达为对照组的9倍,Hedgegog通路荧光素酶表达为对照组的2.5倍(P0.01)；利用Real-time PCR检测TAFs是否激活Hedgehog和TGF-β通路下游基因,结果显示TAFs上调TGF-β通路smad-5与c-myc,Hedgehog通路下游基因Gli-1、Shh、Bcl-2亦可被TAFs活化。 4.趋化因子对Hedgehog和TGF-P信号通路的影响 报告基因检测趋化因子对通路的活化作用,结果发现CXCL16激活TGF-β通路,CCL2、CCL5活化Hedgehog通路。另外,CCL5、CXCL16中和抗体可分别阻断TAFs对Hedgehog与TGF-β通路的活化作用。提示TAFs对两个通路的活化作用部分通过CCL5、CXCL16实现。Real-time PCR检测趋化因子对通路下游基因的作用,结果显示CCL2、CCL5激活Hedgehog通路下游基因Shh、Bcl-2、Gli-1,CXCL16上调TGF-β通路c-myc与smad-5的表达。 [结论] 1.TAFs高表达a-SMA与FSP-1,其增殖和迁移能力高于PTFs。 2. TAFs促进肝肿瘤细胞株的增殖、侵袭、迁移、体内成瘤及转移。 3. TAFs促进肿瘤细胞的上皮-间质转化,维持肝肿瘤细胞的“干细胞特性”。 4. CCL2、CCL5与CXCL16等TAFs分泌的趋化因子通过激活TGF-P与Hedgehog通路促进肿瘤细胞恶性转化。

【关键词】：
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R735.7
【目录】：

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6 陈晖娟;胶原模拟多肽及其对成纤维细胞粘附作用的研究[D];北京协和医学院;2012年

7 曹曼林;2450MHz微波辐射对原代培养的小鼠成纤维细胞增殖活性的影响及其分子机制研究[D];第二军医大学;2008年

8 郑秀丽;贲门腺上皮不同癌变阶段间质成纤维细胞的初步研究[D];河北医科大学;2013年

9 陈平忍;17-β雌二醇对体外培养的盆底功能障碍性疾病患者阴道壁成纤维细胞应力前后的影响[D];河北医科大学;2011年

10 李举;游离二氧化硅粉尘对大鼠循环成纤维细胞作用的体外实验[D];郑州大学;2011年

  本文关键词：肿瘤相关成纤维细胞对肝癌细胞生物学作用及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：161598