羟基红花黄色素A保护氧糖剥夺/复糖复氧损伤大鼠脑微血管内皮细胞的自噬途径研究
发布时间：2024-04-23 04:30
目的体外实验研究羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor Yellow A,HSYA)对氧糖剥夺/复糖复氧(Oxygen Glucose Deprivation/Reoxygenation,OGD/R)损伤大鼠脑微血管内皮细胞(Brain Microvascular Endothelial Cells,BMECs)的保护作用及其可能的自噬调节机制。方法1.OGD/R后大鼠BMECs损伤与自噬调节的关系(1)原代培养新生大鼠的BMECs,采用常规形态学观察结合VIII因子免疫荧光鉴定对大鼠BMECs进行鉴定;(2)采用常规培养箱结合缺氧小室(5%CO2和95%N2)和无糖DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)的方法建立OGD/R损伤BMECs模型,设置OGD/R不同时间点(0h、3h、9h、12h、24h、48h、72h);(3)MTT法和LDH法分别检测OGD/R损伤后细胞增殖活性、细胞膜通透性的变化;(4)透射电子显微镜观察OGD/R损伤后细胞的超微结构变化;(5)Western-Blotting法检测OGD/R损伤后自...
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩略词表（Abbreviation）
前言
第一部分 OGD/R后大鼠BMECs损伤与自噬调节的关系
1 前言
2 实验材料
2.1 实验动物
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
2.4 主要溶液配制
3 实验方法
3.1 BMECs的原代培养及鉴别
3.1.1 BMECs的原代培养
3.1.2 BMECs的鉴别
3.2 OGD/R损伤BMECs模型的建立
3.3 实验分组
3.4 细胞存活率检测（MTT法）
3.5 乳酸脱氢酶（LDH）活性检测
3.6 透射电镜观察自噬体超微结构
3.7 Western-Blotting法检测蛋白表达
3.7.1 蛋白提取
3.7.2 Western-Blotting法检测自噬标志蛋白LC3、Beclin-1 表达
4 统计学分析
5 实验结果
5.1 BMECs的形态学观察与鉴定
5.2 OGD/R不同时间点对BMECs增殖活力的影响
5.3 OGD/R不同时间点对BMECs内LDH活性的影响
5.4 透射电镜观察细胞超微结构
5.5 OGD/R损伤BMECs不同时程自噬的变化
6 讨论
7 结论
第二部分 HSYA调节自噬保护OGD/R损伤大鼠BMECs
1 前言
2 实验材料
2.1 实验动物
2.2 药物
2.3 主要试剂
2.4 主要仪器
2.5 主要溶液配制
3 实验方法
3.1 BMECs的原代培养及鉴别
3.2 OGD/R损伤BMECs模型的建立
3.3 HSYA安全浓度范围筛选（MTT法）
（1）MTT法检测HSYA对正常BMECs的浓度筛选
（2）MTT法检测HSYA对OGD/R损伤BMECs的浓度筛选
3.4 实验分组
3.5 倒置显微镜观察BMECs形态学变化
3.6 透射电镜观察细胞超微结构
3.7 细胞存活率检测（Alamar Blue法）
3.8 LDH活性检测
3.9 Hochest33258染色检测细胞凋亡
3.10 TEER值的测定
3.11 细胞免疫荧光检测LC3蛋白表达
3.12 RT-PCR检测LC3基因表达
3.13 Western-Blotting法检测ZO-1、Beclin-1、LC3蛋白的表达
4 统计学分析
5 结果
5.1 HSYA安全浓度范围筛选
（1）HSYA对正常培养状态下BMECs活性的影响
（2）MTT法检测HSYA对OGD/R时BMECs活性的影响
5.2 BMECs形态学观察
5.3 HSYA对OGD/R损伤BMECs超微结构的影响
5.4 HSYA对OGD/R损伤BMECs增殖活力的影响
5.5 HSYA对OGD/R损伤BMECs内LDH活性的影响
5.6 Hochest33258染色检测细胞凋亡形态
5.7 TEER值的测定
5.8 HSYA对OGD/R损伤BMECs上TJ蛋白表达的影响
5.9 细胞免疫荧光检测LC3蛋白表达
5.10 RT-PCR检测LC3基因表达
5.11 HSYA对OGD/R损伤BMECs自噬标志蛋白表达的影响
6 讨论
7 结论
第三部分 HSYA保护OGD/R损伤大鼠BMECs的自噬调节途径研究
1 前言
2 实验材料
2.1 实验动物
2.2 药物
2.3 主要试剂
2.4 主要仪器
2.5 主要溶液配制
3 实验方法
3.1 BMECs的原代培养及鉴别
3.2 OGD/R损伤BMECs模型的建立
3.3 实验分组
3.4 细胞存活率检测（MTT法）
3.5 LDH活性检测
3.6 Western-Blotting法检测蛋白的表达
4 统计学分析
5 实验结果
5.1 HSYA与ZSTK474合用对OGD/R损伤BMECs的保护作用52
5.2 HSYA与ZSTK474合用对OGD/R损伤BMECs自噬标志蛋白表达的影响
5.3 HSYA与ZSTK474合用对PI3K/Akt/mTOR通路上主要蛋白表达的影响
6 讨论
7 结论
8 展望
参考文献
技术路线图
综述 自噬与脑缺血再灌注损伤
参考文献
个人简历
致谢
本文编号：3962619
【文章页数】：87 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩略词表（Abbreviation）
前言
第一部分 OGD/R后大鼠BMECs损伤与自噬调节的关系
1 前言
2 实验材料
2.1 实验动物
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
2.4 主要溶液配制
3 实验方法
3.1 BMECs的原代培养及鉴别
3.1.1 BMECs的原代培养
3.1.2 BMECs的鉴别
3.2 OGD/R损伤BMECs模型的建立
3.3 实验分组
3.4 细胞存活率检测（MTT法）
3.5 乳酸脱氢酶（LDH）活性检测
3.6 透射电镜观察自噬体超微结构
3.7 Western-Blotting法检测蛋白表达
3.7.1 蛋白提取
3.7.2 Western-Blotting法检测自噬标志蛋白LC3、Beclin-1 表达
4 统计学分析
5 实验结果
5.1 BMECs的形态学观察与鉴定
5.2 OGD/R不同时间点对BMECs增殖活力的影响
5.3 OGD/R不同时间点对BMECs内LDH活性的影响
5.4 透射电镜观察细胞超微结构
5.5 OGD/R损伤BMECs不同时程自噬的变化
6 讨论
7 结论
第二部分 HSYA调节自噬保护OGD/R损伤大鼠BMECs
1 前言
2 实验材料
2.1 实验动物
2.2 药物
2.3 主要试剂
2.4 主要仪器
2.5 主要溶液配制
3 实验方法
3.1 BMECs的原代培养及鉴别
3.2 OGD/R损伤BMECs模型的建立
3.3 HSYA安全浓度范围筛选（MTT法）
（1）MTT法检测HSYA对正常BMECs的浓度筛选
（2）MTT法检测HSYA对OGD/R损伤BMECs的浓度筛选
3.4 实验分组
3.5 倒置显微镜观察BMECs形态学变化
3.6 透射电镜观察细胞超微结构
3.7 细胞存活率检测（Alamar Blue法）
3.8 LDH活性检测
3.9 Hochest33258染色检测细胞凋亡
3.10 TEER值的测定
3.11 细胞免疫荧光检测LC3蛋白表达
3.12 RT-PCR检测LC3基因表达
3.13 Western-Blotting法检测ZO-1、Beclin-1、LC3蛋白的表达
4 统计学分析
5 结果
5.1 HSYA安全浓度范围筛选
（1）HSYA对正常培养状态下BMECs活性的影响
（2）MTT法检测HSYA对OGD/R时BMECs活性的影响
5.2 BMECs形态学观察
5.3 HSYA对OGD/R损伤BMECs超微结构的影响
5.4 HSYA对OGD/R损伤BMECs增殖活力的影响
5.5 HSYA对OGD/R损伤BMECs内LDH活性的影响
5.6 Hochest33258染色检测细胞凋亡形态
5.7 TEER值的测定
5.8 HSYA对OGD/R损伤BMECs上TJ蛋白表达的影响
5.9 细胞免疫荧光检测LC3蛋白表达
5.10 RT-PCR检测LC3基因表达
5.11 HSYA对OGD/R损伤BMECs自噬标志蛋白表达的影响
6 讨论
7 结论
第三部分 HSYA保护OGD/R损伤大鼠BMECs的自噬调节途径研究
1 前言
2 实验材料
2.1 实验动物
2.2 药物
2.3 主要试剂
2.4 主要仪器
2.5 主要溶液配制
3 实验方法
3.1 BMECs的原代培养及鉴别
3.2 OGD/R损伤BMECs模型的建立
3.3 实验分组
3.4 细胞存活率检测（MTT法）
3.5 LDH活性检测
3.6 Western-Blotting法检测蛋白的表达
4 统计学分析
5 实验结果
5.1 HSYA与ZSTK474合用对OGD/R损伤BMECs的保护作用52
5.2 HSYA与ZSTK474合用对OGD/R损伤BMECs自噬标志蛋白表达的影响
5.3 HSYA与ZSTK474合用对PI3K/Akt/mTOR通路上主要蛋白表达的影响
6 讨论
7 结论
8 展望
参考文献
技术路线图
综述 自噬与脑缺血再灌注损伤
参考文献
个人简历
致谢
本文编号：3962619
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zhongyaolw/3962619.html