基于代谢组学的清热化痰通腑方干预卒中相关性肺炎大鼠的作用及机制研究

发布时间：2020-03-18 05:08

【摘要】：目的研究清热化痰通腑方(HTF)对卒中相关性肺炎(SAP)大鼠的干预作用,并基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用(UPLC-QTOF/MS)的代谢组学技术,探讨HTF灌肠治疗SAP的作用机制。方法将21只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术(J)组、模型(M)组和治疗(Z)组(HTF,浓度为lg/ml,剂量为7.6ml/d),每组7只,除J组外,其余两组均采用改良线栓法结合气管注射法建立SAP模型。Z组给予HTF干预,其余两组给予生理盐水对照,疗程均为7天。造模后,每组随机抽取1只大鼠取脑组织行TTC染色观察脑梗死情况;观察余下各组大鼠的一般情况(状态、被毛、活动情况、体温、鼻周分泌物);于造模第1天及造模第7天进行神经功能评分;取三组大鼠肺组织进行铜绿假单胞菌鉴定;采用HE染色法观察各组大鼠脑组织、肺组织病理学变化;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清ET-1、血清IL-1β和肺组织IL-1β的浓度;采用UPLC-QTOF/MS分析技术检测三组大鼠血清中的代谢物。应用主成分分析(PCA)法、正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)法和t检验筛选血清中的代谢物,寻找潜在的生物标志物,通过潜在的生物标志物得到相关代谢通路,发现异常代谢及HTF对异常代谢的调节作用,阐明HTF治疗SAP大鼠的作用机制。结果1.一般情况:实验过程中,J组大鼠状态良好,被毛平顺有光泽,活动灵敏,体温正常,鼻头湿润没有喘促;M组大鼠状态差,被毛乱而无光泽,无精打采,高热,鼻周有大量分泌物并有喘促,Z组大鼠状态一般,被毛缺乏光泽,活动欠佳,低热,鼻周有少许分泌物。2.神经功能评分:J组造模第1天及第7天神经功能评分均为0分;造模第1天M组与Z组神经功能评分差异无统计学意义(P0.05);造模第7天,Z组神经功能评分显著低于M组;M组造模第7天与第1天相比神经功能积分升高;Z组造模第7天与第1天相比神经功能积分显著降低。3.脑、肺组织HE染色脑组织HE染色:J组脑组织几乎无变化,细胞无显著肿胀,排列整齐,间质均匀,无炎症细胞浸润。M组细胞排列紊乱,有大量炎症性细胞浸润,小胶质细胞增多,光镜下可见神经元细胞、胶质细胞及微血管周隙均增宽、神经纤维网疏松,呈海绵状或空泡样。Z组脑组织炎症浸润程度较M组显著减轻。肺组织HE染色:J组大鼠肺组织肺泡管周围及肺泡囊周围未见炎性细胞浸润;M组可见大量炎性细胞浸润,肺组织大片实化,肺泡的轮廓隐约可见;Z组炎性细胞浸润较M组少,肺组织实化较M改善,肺泡的轮廓可见,但炎症浸润较J组显著。4.ELISA检测结果:与假手术组相比模型组的血清IL-1β浓度显著升高(P0.01),与模型组相比,治疗组血清IL-1β浓度显著低于模型组(P0.01);与假手术组相比模型组的血清ET-1浓度显著升高(P0.01),与模型组相比,治疗组血清ET-1浓度显著低于模型组(P0.01);与假手术组相比模型组的肺组织IL-1β浓度显著升高(P0.01),与模型组相比,治疗组肺组织IL-1β浓度显著低于模型组(P0.01)。5.大鼠血清的代谢组学分析:共筛选出22种潜在生物标志物,其中,M组与J组相比,血清中3-甲氧基-L-酪氨酸、白三烯B4、苯乙酰甘氨酸、磷酸丝氨酸、前列腺素E2、前列腺素F2α、血栓素B2、11-脱氧皮质酮、19-氧睾酮、前列腺素F1α、油酸、棕榈酸的浓度显著升高(P0.01),前列腺素E3的浓度升高(P0.05),雌激素、癸二酸、脱氧胞苷、酪氨酸、莽草酸、顺乌头酸的浓度显著降低(P0.01);N-乙酰谷氨酸盐酸、胞苷、维生素E的浓度降低(P0.05);Z组与M组相比,N-乙酰谷氨酸盐酸、雌激素、癸二酸、脱氧胞苷、胞苷、酪氨酸、莽草酸、顺乌头酸、维生素E的浓度显著升高(P0.01),3-甲氧基-L-酪氨酸、白三烯B4、苯乙酰甘氨酸、磷酸丝氨酸、前列腺素E2、前列腺素F2α、血栓素B2、11-脱氧皮质酮、19-氧睾酮、前列腺素E3、前列腺素F1α、油酸、棕榈酸的浓度显著降低(P0.01)。涉及15条相关代谢通路,分别为:花生四烯酸代谢,脂肪酸生物合成,嘧啶代谢,柠檬酸循环(TCA循环),类固醇激素生物合成,线粒体脂肪酸伸长,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,泛醌和其他萜类醌生物合成,苯丙氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,乙醛和二羧酸代谢,脂肪酸代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢,氨酰tRNA生物合成,精氨酸和脯氨酸代谢。按影响值的大小得到密切相关的7条代谢通路,依次为:苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,柠檬酸循环(TCA循环),花生四烯酸代谢,类固醇激素生物合成,脂肪酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,嘧啶代谢。涉及的异常代谢为脂质代谢(花生四烯酸代谢、类固醇代谢、硬脂酸代谢、其他脂质代谢),能量代谢,其他(核糖核酸与脱氧核糖核酸合成、嘧啶代谢)。结论1.HTF对改良线栓法结合气管注射法所致的SAP大鼠具有较好的干预作用,表现为降低SAP模型大鼠神经功能评分;减轻SAP模型大鼠脑组织、肺组织的炎症;降低SAP模型大鼠血清IL-1β、ET-1及肺组织IL-1β含量;HTF对SAP大鼠脑组织以及肺组织具有抗炎和改善缺血缺氧的作用。2.改良线栓法结合气管注射法所致的SAP大鼠模型血清代谢轮廓发生了显著变化,主要表现为22种生物标志物在血清中含量的上调或下调,扰动的代谢通路共15条,其中密切相关有7条,涉及的异常代谢有脂质代谢、能量代谢等。HTF对SAP大鼠脑组织以及肺组织的抗炎和改善缺血缺氧的作用机制可能与通过调节以上相关通路,回调SAP大鼠血清代谢标志物水平,使异常代谢恢复正常有关。
【图文】：

铜绿假单胞菌,TTC染色,肺组织,大鼠

图 1 三组大鼠脑组织 TTC 染色Fig. 1 TTC staining of brain tissue in three groups of rats组织铜绿假单胞菌鉴定J 组大鼠的肺组织匀浆未培养出铜绿假单胞菌，M 组及 Z 组大鼠的肺组均培养出铜绿假单胞菌。染色结果各组大鼠脑组织 HE 染色J 组脑组织几乎无变化，细胞无显著肿胀，排列整齐，间质均匀，无胞浸润。M 组细胞排列紊乱，有大量炎症性细胞浸润，小胶质细胞光镜下可见神经元细胞、胶质细胞及微血管周隙均增宽、神经纤维

HE染色,肺组织,肺泡囊,肺泡管

图 2 三组大鼠脑组织 HE 染色（×200）Fig.2 HE staining (x 200) of brain tissue in three groups of rats5.2 各组大鼠肺组织 HE 染色J 组大鼠肺组织肺泡管周围及肺泡囊周围未见炎性细胞浸润；M 组可见大量炎性细胞浸润，肺组织大片实化，肺泡的轮廓隐约可见；Z 组炎性细胞浸润较 M 组少，肺组织实化较 M 改善，肺泡的轮廓可见，，但炎症浸润较 J 组显著。（如图 3）。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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