CYP450 3A及其等位基因在体外药物代谢和药物相互作用中的对比研究

发布时间：2016-10-10 22:01

  本文关键词：CYP450 3A及其等位基因在体外药物代谢和药物相互作用中的对比研究，由笔耕文化传播整理发布。

《西北大学》 2009年

CYP450 3A及其等位基因在体外药物代谢和药物相互作用中的对比研究

李拴美  

【摘要】： 目的:人细胞色素P450(CYP450)在肝脏中是含有亚铁血红素蛋白的超基因家族。参与大部分药物的代谢过程,也被称为混合功能氧化酶或单加氧酶。CYP3A被认为是人类P450家族在某些器官中最主要的功能形式。约占肝脏中总P450含量的30%,参与45%-60%常用药物在体内的代谢转化过程,包括氧化、过氧化或者还原等。CYP3A4和CYP3A5是肝脏和肠道中主要的CYP3A功能形式,代谢大部分相同的底物,但具有不同的代谢常数。而且由于这两者在个体中含量的不同,因此可能具有不同的药物代谢能力。CYP3A4亚家族中由于基因、年龄、疾病状态等因素,酶活性之间具有明显的个体差异,不仅表现在肝脏表达水平差异约40倍,且个体对药物的体内代谢能力也相差10倍左右。其中,基因因素的作用约占60%-90%。目前,发现许多CYP3A4等位基因可能是造成个体间药物代谢差异的一个重要因素。实验目的是:通过体外的对比研究,找出CYP450 3A的CYP3A5~*1A(w]r)(野生型)和CYP3A4~*1A(WT)和CYP3A4~*3(M445T),~*4(I118V),~*17(F189S),~*18(L293P)等位基因在药物代谢和药物抑制中的差异,分析其差异性存在的原因。 方法:在已有的CYP3A4和CYP3A5的野生型模板情况下,利用不对称PCR的方法在CYP3A4野生型基因中引入各等位基因的突变位点,利用酶K_(pn)Ⅰ和XhoⅠ消化产生插入片段,与含有同样酶切位点的大肠杆菌pYES2/CT载体进行连接,然后转化到大肠杆菌中。通过氨苄青霉素抗性标记筛选出重组子,初步鉴定后,再通过测序确认,无非同义突变后,转化入整合有POR基因的酵母菌株中,利用半乳糖诱导重组子在酵母系统中进行表达,差速离心法制备得到微粒体。并用CYP3A的特异性反应:荧光底物DBF(Dibenzylfluorescein)的去甲基化和硝苯地平的氧化,进行酶动力学的分析,非线性回归分析法计算出K_m值和V_(max)值,进而得到体外代谢的内在清除率CL_(int),以此为依据比较各重组酶的代谢差异。与此同时,使用原生型和各突变株微粒体蛋白在两种检测系统中分别对19种和6种药物进行筛选,求出其IC_(50)值,研究药物抑制的相互作用。 结果:酿酒酵母表达体系是CYP450酶系理想的体外表达体系。体外酶动力学和药。物抑制的对比研究中发现:除CYP3A4~*17等位基因酶外,3A5-WT,3A4-WT,和CYP3A4~*3,~*4,~*18均能将DBF和硝苯地平代谢成相应的产物,~*17号由于活性几乎丧失因此也无法进行后续的药物抑制实验。 在CYP3A4和CYP3A5的对比研究中发现:3A5-WT对DBF和硝苯地平的亲和力较3A4-WT的低(K_m分别是后者的2.0和3.0倍)。3A5-WT对两种底物的CL_(int)分别比3A4-WT降低了2倍和3倍(p0.05,n≥3)。在两种底物的抑制实验中,两株野生型均能被酮康唑强烈的抑制,但是对CYP3A5-WT的抑制没有3A4-WT的强,对前者的IC_(50)值分别是0.012和0.036μM,对后者的IC_(50)值分别是0.040和0.049μM。另外18种药物除了那些对两者都不存在抑制的药物外,平均而言大部分药物对3A5-WT的IC_(50)是对3A4-WT的4倍。 在3A4-WT与其等位基因的对比研究中:各等位基因对DBF的亲和力与WT相当(K_m相近),~*3和~*18的CL_(int)分别是WT的3.1和3.8倍(p0.05),~*4仅是WT的1.3倍(p=0.1010)。各等位基因对硝苯地平的亲和力均比WT低(K_m依次分别是WT的1.6、2.0和1.3倍),~*4和~*18的CL_(int)分别是WT的0.7和2.6倍(p0.05),~*3与WT相当(p=0.7676)。以DBF为底物时,药物对WT和各等位基因的抑制程度排序为:酮康唑地尔硫卓曲格列酮舍曲林维拉帕米氟西汀大扶康奥美拉唑红霉素来适可文迪亚泰洛平普拉固=立普陀=华法林=万络=辛伐他汀=西咪替汀。药物对WT和各等位基因酶的抑制程度的排序为:~*3~*18WT~*4。以硝苯地平为底物时,药物对WT和各等位基因的抑制程度排序为:酮康唑地尔硫卓维拉帕米大扶康西乐葆万络,六种药对WT和各等位基因酶的抑制程度的排序为:WT~*18~*3~*4。针对某种药物的具体抑制情况,3A4多态性现象依然存在,且存在明显的底物依赖现象。氨基酸顺序不同或者改变后,酶动力学特征发生明显改变,且对药物抑制的程度也发生了一定变化。 结论:等位基因和WT相比,氨基酸改变后,酶动力学特征与野生型有明显差异,且对药物抑制的程度也发生了改变。此外,本实验成功构建了在酵母表达系统中高效表达CYP3A重组酶的方法,表达出的重组酶具有活性高、稳定性好等特点。同时也建立起荧光和HPLC两种针对于CYP3A4遗传多态性研究的药物筛选平台,为进一步研究CYP450的研究奠定了良好的基础,除可以作为一种新药临床前高通量筛选的方法外,而且也有助于推动临床个体化用药的发展。

【关键词】：
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R96
【目录】：

中文摘要3-5

Abstract5-10

缩略语表10-11

前言11-13

第一章 文献综述13-44

1.1 细胞色素P450及其在药物代谢研究中的作用13-24

1.1.1 CYP450的发现史13-14

1.1.2 CYP450的分布特征14

1.1.3 细胞色素P450的命名14-15

1.1.4 细胞色素P450的结构特征15-17

1.1.5 P450酶系的催化机制17-18

1.1.6 P450酶系的个体差异18-19

1.1.7 CYP450酶系的主要功能19-22

1.1.8 细胞色素P450的应用22-24

1.2 CYP3A4/CYP3A5其单核苷酸多态性的研究进展24-35

1.2.1 CYP3A亚家族及其分布24-25

1.2.2 CYP3A的基因结构及其表达调控25-26

1.2.3 CYP3A基因多态性及其突变频率分布26-30

1.2.4 CYP3A与药物代谢30-31

1.2.5 CYP3A与药物相互作用31-33

1.2.6 CYP3A与疾病易感性33

1.2.7 3A4基因多态性的应用前景33-35

1.3 药物代谢体外研究模型的发展35-41

1.3.1 CYP体外代谢研究体系35-36

1.3.2 CYPs代谢动力学研究36-37

1.3.3 CYP450s异源表达系统37-41

1.4 CYP3A4药物检测系统的发展41-42

1.5 立题背景及意义42-44

第二章 CYP3A4及CYP3A5的体外代谢差异性研究44-85

2.1 重组酶的体外构建表达和纯化44-59

2.1.1 材料44-46

2.1.2 实验方法46-53

2.1.3 实验结果与分析53-57

2.1.4 讨论57-59

2.2 重组酶的酶学分析和药物高通量抑制试验59-85

2.2.1 材料59-62

2.2.2 实验方法62-68

2.2.3 实验结果与分析68-82

2.2.4 讨论82-85

第三章 重组CYP3A4酶及其四个等位基因的体外代谢差异研究85-101

3.1 重组酶的体外构建表达和纯化85-90

3.1.1 材料85

3.1.2 实验方法85-87

3.1.3 实验结果与分析87-90

3.2 重组酶的酶学分析和药物高通量抑制试验90-101

3.2.1 材料90

3.2.2 实验方法90

3.2.3 实验结果与分析90-96

3.2.4 讨论96-101

全文总结101-103

参考文献103-109

硕士期间发表论文109-110

致谢110

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本文编号：136768