线粒体单核苷酸多态性AS-PCR复合检测体系的建立及法医学应用研究

发布时间：2017-05-03 11:16

  本文关键词：线粒体单核苷酸多态性AS-PCR复合检测体系的建立及法医学应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着分子生物学的发展,从被称为第一代遗传标记的DNA指纹技术,到当前法庭科学主流使用的荧光标记PCR-STR复合扩增技术,再到被称为第三代遗传标记的SNP技术,DNA鉴定在法庭科学中发挥着日益重要的作用。在法医学实践中多是检测遵循孟德尔遗传定律的常染色体STR以及遵循父系遗传的Y染色体STR,然而常规STR分型系统并不是在每个案件中都能发挥作用——如高度降解的DNA样本、无核样本以及需要进行母系亲缘关系鉴定的样本等。在这种情况下,检测遵循母系遗传的线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)则十分有意义。mtDNA是人类基因组的重要组成部分,共含有16569个碱基对,为一条双链闭合环状的DNA分子,分为编码区和非编码区(控制区),其中控制区包含有高变I区(Hypervariable Region I, HVI)和高变II区(Hypervariable Region II, HVII),编码区内则含有散在的SNP位点。与核基因组相比,mtDNA位于核外,具有多拷贝、高突变率、母系遗传、几乎不发生重组等特点,使其在法医学、群体遗传学、人类生态学、分子进化和考古学中具有重要的应用价值。在法医学实践中,常规的mtDNA检测方法是对HVI和HVII进行直接测序,然而测序步骤繁琐费时,对DNA模板要求较高,有时需重复测序,且区段有限,影响个体识别率。近年来,随着对人类起源进化以及群体遗传学的研究,世界各地大量的线粒体全序列数据被报导,并以此为基础依照不同的SNP分型构建了系统进化树,定义线粒体单倍型,为人类进化、考古学以及法医学等研究提供了基础框架。依据进化树选择决定单倍型的SNP位点进行检测成为mtDNA检测的趋势。目前国内外已建立起来的mtDNA SNP分型的方法主要有PCR-RFLP、 DHPLC、焦磷酸测序法、SNaPshot以及等位基因特异性PCR(AS-PCR)等技术。其中AS-PCR技术是基于引物3’端碱基对扩增反应的开关作用,通过对引物的巧妙设计来达到有效分析单核苷酸多态性的目的,与PCR-RFLP、DHPLC、SNaPshot等方法相比具有操作简便、耗时短、成本低、结果亦可靠等优点。本课题依据最新的系统进化树筛选mtDNA SNP位点,应用AS-PCR结合毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)检测技术,建立了一套简便快速、适用于中国人群且可投入法医学实际应用的线粒体SNP复合扩增检测体系。目的为法医学实践提供线粒体SNP快速、简便而可靠的检测手段,筛选60个针对中国人群单倍型的位点,应用AS-PCR结合CE,建立一套四色荧光标记复合扩增检测体系,并对其可行性进行评估；应用该体系对200例汉族无关个体以及200例维吾尔族无关个体进行单倍型频率调查以及人群遗传关系比较,为群体遗传学提供新的数据；同时将该体系应用于实际案件中,探讨其法医学应用价值。方法筛选60个线粒体SNP位点,分为三组。基于AS-PCR原理,自行设计具有长度差异的上游(下游)等位基因特异性引物及下游(上游)通用引物,各组通用引物的5’端分别标记蓝色6-FAM、绿色HEXTM以及黄色TAMRATM荧光。通过正交法对体系中各组分以及PCR反应的参数进行调整,建立三组复合检测体系。应用直接测序法对该方法进行验证。为保证SNP分型的重复性和准确性,开发了SNP标准分型阶梯(ladder)。用建立的体系对200份汉族无关个体以及200份维吾尔族无关个体进行检测分型,计算各种单倍型的频率。进一步收集其他人群单倍型频率数据,用Arlequin v3.1软件进行人群比较分析。对已知浓度样本系列稀释后检测以获得灵敏度；检验猪、鸭、鸡、鱼、羊和大肠杆菌DNA进行种属特异性分析；检测含有腐殖酸、血红蛋白、靛蓝、钙离子、EDTA、血红素等抑制剂的DNA样本进行耐受能力测试。对实际检案中的无核检材(毛干)、降解检材(骨骼)以及需要进行母系亲缘关系鉴定的检材(姐妹关系鉴定)进行检测,评估其法医学应用价值。结果本研究成功建立了mtDNA SNP 60位点的四色荧光复合扩增检测体系,实现了对线粒体SNP位点的高通量检测。突变型和野生型为相差2-4个碱基的产物峰,其分型结果与直接测序结果一致。200例汉族样本及200例维吾尔族样本均可得到清晰分型,其中汉族样本可被归入72种单倍型,单倍型频率为0.978,DP值达97.28%；维吾尔族样本可被归入61种单倍型,单倍型频率为0.972,DP值为96.69%。遗传关系分析显示两个人群有差异,且差异具有统计学意义。灵敏度检测结果显示,FAM及HEX荧光标记的两组灵敏度较高,可达0.1pg/μL总DNA, TAMRA组为0.5pg/μL总DNA。在0.5-2pg/μL范围之内可得到较好的分型结果。种属特异性检测中,对猪、鸭、鸡、鱼、羊和大肠杆菌DNA均无特异性扩增产物。耐受能力测试显示对PCR抑制剂均有一定的耐受力。对实际检案的检材能够进行分型。结论本研究建立的线粒体SNP位点四色荧光复合扩增检测体系,操作简便,结果可靠,灵敏度高,与直接测序法、微测序法等相比较,对DNA模板量要求较低,且能够进行快速筛查。通过自行设计的引物,将AS-PCR技术与CE相结合,能在现有的法医STR检测平台上,达到高通量、低成本、可重复检测线粒体SNP的要求。根据进化树以及文献报导选择针对中国人群单倍型的位点,在汉族人群以及维吾尔族人群中显示出较高的多态性。对毛干、骨骼等能够进行分型,满足法庭科学检验中母系亲缘关系检验以及高降解疑难检材的检测需求。
【关键词】：线粒体DNA 单核苷酸多态性 等位基因特异性PCR 单倍型 法医学应用
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：D919
【目录】：

• 英文缩写4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-13
• 第一部分 线粒体单核苷酸多态性AS-PCR复合检测体系的建立13-34
• 1 材料与试剂13
• 2 主要实验方法13-26
• 3 结果26-29
• 4 讨论29-34
• 第二部分 群体调查与数据分析34-41
• 1 材料与试剂34
• 2 主要实验方法34-35
• 3 结果35-39
• 4 讨论39-41
• 第三部分 可行性评估及法医学应用41-52
• 1 材料与试剂41
• 2 主要实验方法41-43
• 3 结果43-51
• 4 讨论51-52
• 结论52-53
• 参考文献53-58
• 附录一 综述58-73
• 参考文献67-73
• 附录二 在读期间撰写论文及获奖情况73-74
• 致谢74-75

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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中国硕士学位论文全文数据库 前4条

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  本文关键词：线粒体单核苷酸多态性AS-PCR复合检测体系的建立及法医学应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：342928