左旋硫酸沙丁胺醇肺部吸入给药的制剂与药效与作用研究

发布时间：2015-01-13 15:03

 

【摘要】 沙丁胺醇为一种β2受体激动剂，能选择性激动支气管平滑肌的β2受体，有强大而迅速的支气管扩张作用。左旋硫酸沙丁胺醇是从消旋硫酸沙丁胺醇拆分得到的高光学纯的化合物，与消旋体相比有高效低毒的特点。肺部吸入以其独特的优势成为治疗呼吸系统疾病理想的给药途径。本文主要研究硫酸沙丁胺醇、左旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液，并对其进行质量研究和药效评价，研究内容如下：(1)拟定了消旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液的配方，按照中国药典药品质量标准要求，对其进行了详细的质量研究，并对试制的三批样品进行了包括影响因素试验、加速试验和长期试验在内的稳定性考察。在此基础上，对左旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液进行了同样的研究。其研究结果为拟定左旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液的质量标准提供必要依据。(2)参考欧洲药典(EP7.3)和美国药典对吸入制剂指标的评价要求，分别使用新一代药用多级撞击器和呼吸模拟装置分析了自制制剂与市售制剂的粒径分布情况和剂量递送均一性，利用高效液相色谱法进行定量。结果显示：自制左旋和消旋雾化吸入溶液的FPF%(可吸入颗粒百分数)分别高达72.81%和71.97%，与万托林（71.96%）和达芬科闯（71.78%）相比无显著性差异，且MMAD（μm，质量中位直径）的大小也无显著性差异，依次为3.278、3.321、3.390、3.406；剂量递送均一性测试结果显示自制制剂与市售的万托林、达芬科闯在剂量递送速率和总的药物递送量方面具有可以性。上述对制剂进行的体外分析结果支持了自制制剂的配方合理性和质量可靠性。(3)利用组胺刺激豚鼠诱发气道高反应性，建立了哮喘急性发作模型，通过给予低、中、高梯度药物剂量给药观察左旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入的药效发挥程度，统计分析显示：依次吸入低、中、高剂量的药液后，分别给予给予15ug/ml,0.5ml同等程度组胺刺激，豚鼠气道阻力上升率依次为102.67%、55.23%、25.53%，与空白组胺刺激的气道阻力上升值425.37%相比有极显著差异，动态肺顺应性的变化率也从空白组的-83.85%分别上升为-62.24%、-48.82%和25.18%。与加倍剂量给药的消旋硫酸沙丁胺醇对肺功能的改善作用相比无显著差异，有力的支撑了进行左旋硫酸沙丁胺醇研究和开发的合理性与重要意义。 

第一章 绪论

1.1 哮喘现状概述
1.1.1 国内外患病形势
在过去的五十年里，西方国家患哮喘及相关过敏性疾病的人群增加显著，这主要归咎于城市化和不断改变的饮食以及生活方式[1]，同时哮喘疾病的流行性、发病率和死亡率也是逐年增加[2,3]，在我国哮喘患病率也呈逐年上升趋势，成人发病率为 0.7%~1.5%，儿童为 0.11%~2.03%。全国约有 2000 万患者之多[4]。尽管存在不同国家、地区和人群间的差异，但可以肯定的是哮喘有愈发严重的趋势。在 2000 年由全国儿科哮喘协作组和香港中文大学共同完成的一项面向全国儿童哮喘情况调查的结果显示，我国的哮喘患病率明显上升（统计学有显著意义），从 1990 年的 0.9%[5]上升到了 2000 年的 1.5%[6]，十年之内增加了 64.8%，与全球范围内哮喘患病率普遍升高的趋势是一致的。
在今年由首都儿科研究所、北京大学第一医院、过敏与哮喘医患联盟（中国）举办的“世界哮喘日”宣传教育活动中，世界卫生组织全球哮喘防治创议顾问及推广委员会委员、首都儿科研究所哮喘防治教育中心陈育智教授透露了这样一个事实：2000 年~2010年，我国 0-14 岁儿童的哮喘患病率上升了 50%左右！这印证了很多儿科医生的主观感受—哮喘患儿在逐年增加。几十年来哮喘在我国发病率在逐渐上升，陈育智教授对此深有体会，她曾主持 3 次全国儿童哮喘的流行病学调查工作：在 1990 年，我国 0-14 岁儿童的哮喘平均患病率为 1.08%；2000 年，这个数字增加到 1.97%；而 2010 年第三次全国儿童哮喘儿童流行病学调查数据显示，儿童哮喘患病率达到了 3.01%，在 2000 年的基础上上升了 50%左右。而在欧美形势也不容乐观，根据美国疾病防控中心的最新统计数据显示，在美国每 11 个儿童中就有 1 个患有哮喘；此外，每 5 个儿童中就有 1 个因为哮喘发作必须就诊于急救中心，每年政府需要花费数十亿美元用于儿童哮喘发病住院就医[7,8]。因此有国外专家预测，到 2020 年，哮喘疾病会成为世界第三大杀手。
1.1.2 哮喘发病机理
哮喘目前可以说是世界性难题，不仅发病机制未完全清楚，同时确诊为哮喘的患者在治疗上也有诸多困难。鉴于哮喘发病机制的复杂性，目前还没有哪种学说或者解释可以完全阐明其整个发病机理，但有很多学者从不同方面做了研究，并取得了不错的进展。气道炎症机制侧重的是哮喘发病中各种炎症细胞扮演的角色，不同类型的细胞会释放多种介质和细胞因子如血小板活化因子、白三烯、前列腺素等介质以及 IL-4、IL-9、IL-13等细胞因子，这些物质在变应原刺激机体后，大量释放使机体细胞出于“致敏状态”，当变应原再次接触机体，这些物质就会引起气道平滑肌痉挛、血管通透性增加，气道粘膜水肿充血，笔耕文化传播，最终诱发气道高反应性[9]。呼吸道上皮细胞是炎症发生、免疫反应的重要场所，它影响着哮喘病变中机体对外界变应原、病毒和环境污染物的响应。它可表达对环境刺激因子起监测作用的受体以及分泌内源性危险信号，这两者激活树突细胞并使先天免疫和获得性免疫功能发挥作用。对上皮细胞功能的深入理解有助于更好地了解哮喘发生和恶化的机理[10]。而对于病毒感染和过敏性疾病（比如过敏性鼻炎和皮炎）在哮喘发生和发展过程中所扮演的重要角色，也使人们对哮喘的发病机理和治疗手段有了进一步的认识[11]。上述研究结果足以证明哮喘发病机理的复杂性和交错性，同时也给哮喘治疗带来了更大的挑战。但众多专家们对于哮喘发病机理的不断深入研究和得出的肯定性结论有助于医药从业人员更好的理解这种疾病，并提出针对性的治疗方案。
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1.2 哮喘的控制和治疗
1.2.1 临床治疗方案
哮喘作为一种慢性疾病，儿童在初期如不及时治疗很容易发展为成人哮喘而危害终身，因此早期诊断、早期治疗对于控制哮喘非常关键。目前来说临床中已采用了多种方法用于治疗哮喘，对于不同发病时期和症状的患者，哮喘的治疗应各有不同，有的采用联合用药，比如糖皮质激素类药物布地奈德和硫酸沙丁胺醇联合用药治疗[12]以及异丙托溴铵联合硫酸沙丁胺醇给药雾化吸入[13]；有的采用单独给药[14]。治疗手段既有基于控制目的需要长期每天使用的药物如糖皮质激素和长效 β2 受体激动剂福莫特罗、班布特罗以及沙美特罗等；也有按需使用的缓解药物，这主要针对于病症急性发作时迅速解除支气管痉挛缓解哮喘症状，避免患者因呼吸困难而有生命危险，使用的有抗胆碱能药物如异丙托溴铵、阿托品以及速效 β2受体激动剂如沙丁胺醇、特布他林等。
但事实是很多患者在发病早期，由于症状不显著或是医疗水平所限被“误诊”而丧失了早期的最佳治疗机会，最终发展为不可逆的成人哮喘。在 2010 第三次全国儿童哮喘儿童流行病学调查中发现有 30%的患儿在早期未明确诊断哮喘，且多数是在半岁~2 岁病毒感染后被诊断为“肺炎、支气管炎”等感染性疾病治疗，采用不恰当的应用抗生素及短期解痉治疗，未长期正规给予抗气道炎症或担心吸入激素而丧失了早期治疗的机会。因此对于哮喘的诊断和治疗规范方法才能更好的控制该疾病的恶化和蔓延。
在过去几十年中，在有关哮喘发病机制的研究和有效控制哮喘的治疗方案方面都取得了巨大进展，在 1993 年,美国国立心肺血液研究所与世界卫生组织合作起草了全球哮喘管理和预防策略的报告,同时推行全球哮喘防治创议(Global Initiative for Asthma ，GINA), GINA 的目标包括：提高哮喘作为一个全球性的公共卫生问题的认识；提供诊断和治疗哮喘的关键性建议；为不同健康需求、不同的健康服务机构和卫生资源提供相应的策略；为全球社会指明具有特殊意义的研究领域。
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第二章 消旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液质量研究

2.1 引言
肺部的结构不同于消化道，从肺部进入的颗粒（包括药物和辅料）是较难被清除出体外的，因此通过肺部途径进行的给药所用的辅料要求越少越好，在保证药效的前提下尽可能的不加或者少加其他的附加剂，即使必须要用也应是可以被人体代谢的，同时尽可能通过制剂的手段减少辅料进入支气管以下的部位，以免影响肺的正常生理功能。已有研究表明为控制微生物限度添加有苯扎氯铵的吸入溶液会导致哮喘患者产生支气管痉挛，概率约为 3%[83]。
消旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液在国内已有上市，自国内有厂家申报开始，国家药监局已先后几次颁发文件对该剂型的质量标准不断进行提高，随着科技的发展和技术的日益成熟，其质量标准更加规范，力求更加系统和全面的评价该制剂，但现行的最新版中国药典(2010 版)中暂时未将该制剂的质量标准纳入其中。目前最新的质量标准是 2012年 3 月国家食品药品监督管理局下发的十八种药品标准修订件中提出的，较早前颁布的标准相比，修订了含量测定的浓度，增加了有关物质检测的要求，并提出了色谱条件以及系统适用性的概念。本次颁布的标准中有关物质和含量测定色谱条件均与欧洲药典5.5 版以及英国 2010 版中硫酸沙丁胺醇的质量规范具有很高的同一性，说明国家药监局在逐渐的提高国内的药品标准并向国际标准看齐。该质量标准对雾化溶液的各个控制要求做了明确的规定，本研究中常州亚邦制药公司生产的符合中国药典标准的消旋硫酸沙丁胺醇原料药，作为临床前研究的小试生产以及考虑到现有的实验室研究条件，本研究中重点控制的指标是有关物质和含量测定。
目前国内市售的消旋沙丁胺醇雾化吸入溶液（万托林、达芬科闯）的规格均以 20 ml瓶装规格为主，浓度为 5 mg/ml。因此在使用时一般需要经过生理盐水稀释后方可雾化吸入。综合肺部吸入给药开发的安全性以及患者使用时的方便性、依从性。本实验中选择的溶剂体系为不含苯扎溴铵等防腐剂的溶液，配置浓度选择时考虑市售处方以及后续进一步的左旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液的研究最终拟订为 2.5 mg/ml，同时硫酸沙丁胺醇制备为水溶液后的稳定性也是控制制剂质量的重要因素，雾化吸入溶液的制备必须保证药物粒子在水溶液中有良好的物理和化学稳定性。早在 1990 年就有学者对硫酸沙丁胺醇的水溶液稳定性进行了详细的研究，其结果表明在 pH 为 3.5 时，硫酸沙丁胺醇有最大的稳定性[84]。因此本研究中最终拟定的配方为：无色或几乎无色的澄清透明等渗溶液，规格为 2.5mg/ml(10 ml)，pH 范围为 3.0～5.0。
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2.2 材料与方法
2.2.1 实验仪器与试剂
2.2.2 实验方法
2.2.2.1 有关物质检测方法的研究与验证
1、色谱条件
色谱仪：Shimadzu LC-10ATvp
色谱柱：Inertsil C8-3 (250×4.6 mm，5  m)
流动相：以庚烷磺酸钠溶液[取庚烷磺酸钠 2.87 g 与磷酸二氢钾 2.5 g，加水溶解并稀释至 1000 ml，用磷酸溶液（1→2）调节 pH 值至 3.65]-乙腈（78:22）为流动相
检测波长：220 nm
流速：1 ml/min
进样量：20 μl
柱温：室温
2、方法学验证
(1) 溶液的配制
取消旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液(2.5mg/ml，以下简称雾化溶液)适量，用流动相稀释制成每 1 ml 中约含沙丁胺醇 2 mg 的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1 ml，置 100 ml 量瓶中，加水稀释并定容至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(2) 系统适用性试验
取硫酸沙丁胺醇对照品（100328-200703）与硫酸特布他林对照品（100273-199701）
适量，加流动相溶解并稀释制成每 1 ml 中各含约 0.2 mg 的溶液，作为系统适用性试验溶液，经 0.45μm 滤膜过滤后进样分析，重复进样 5 次。
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第三章 左旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液质量研究 ...............42-55 
3.1 引言............................ 42-43 
3.2 材料与方法 ....................43-47 
3.2.1 实验仪器与试剂 ..................43-44 
3.2.2 实验方法....................... 44-45 
3.2.3 三批小试制剂的检测与稳定性考察................... 45-47 
3.3 结果与讨论......................... 47-54 
3.3.1 不同结合盐形式引湿性比较................... 47-48 
3.3.2 粉末衍射结果比较 ...........48-50 
3.3.3 三批小试制剂检测 ........................50-54 
3.3.4 稳定性考察................. 54 
3.4 本章小结 .................................54-55 
第四章 雾化吸入溶液粒径分布与剂量递送研究................. 55-68 
4.1 引言 .......................55-59 
4.2 材料与方法 ......................59-62 
4.2.1 实验仪器与试剂 .........................59-60 
4.2.2 实验方法.......................... 60-62 
4.3 结果与讨论 ..................62-67 
4.3.1 标准曲线 ................62-63 
4.3.2 粒径分布 .................63-66 
4.3.3 剂量递送 ..............................66-67 
4.4 本章小结 ...................................67-68 

第五章 左旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液药效作用研究

5.1 引言
哮喘是呼吸系统中的常见病与多发病，关于其发病机制、新疗法的安全性以及可靠性评价和新药研发中制剂的疗效与作用评价都主要是依赖于动物实验，但是动物自发形成的变应性哮喘是很少见的，而动物与人体的差异性使得建立的动物哮喘模型很难完全的模拟人类哮喘，因此只能依据现有医学知识，在动物身上模拟哮喘的某些特征。实验室常用来模拟人类支气管哮喘的动物种类很多，比如豚鼠、大鼠、小鼠、家兔等，本文中以豚鼠作为实验动物。
豚鼠又称荷兰猪（Guniea pig），在动物学中的分类是哺乳纲啮齿目豚鼠科豚鼠属，豚鼠的生活习性和解剖生理特点使其成为研究呼吸系统疾病尤其是复制气喘模型的首选动物，豚鼠对组织胺极敏感，所以很适合作平喘药和抗组织胺药的研究，被组胺致敏后的豚鼠，其支气管的过敏反应状态正是常用的“速发型”支气管收缩模型[105]。这种模型的发病机制与人类的哮喘症相仿，同属于 I 型变态反应，可以很好的模拟人类哮喘急性发作中的病症，比如气急、喘息、呼吸困难等。以豚鼠来构建哮喘模型有很多好处，它价格低廉，繁殖以及饲养简便，被变应原刺激后产生的支气管收缩反应与人类支气管哮喘中的收缩特点相同，可以形成很好的气道炎症模型，对于抗哮喘药物的初步作用机理以及药效评价来说是很好的选择。
沙丁胺醇是直接与支气管平滑肌的 β2受体结合引起支气管扩张，药效发挥迅速，它主要用于哮喘急性发作时的症状缓解，避免患者因极度呼吸困难而窒息死亡，因此对于它的药效作用评价最重要的是选择能反映支气管平滑肌状态的生理指标。目前认为最主要的呼吸力学指标为肺功能的测定：气道阻力和动态肺顺应性[106]。气道阻力是指气道内单位流量所产生的压力差。通常用(气道口腔压-肺泡压)/流量来计算，以每秒钟内通气量为 1L 时的压力差来表示。临床适用于各种阻塞性通气功能障碍性疾病以及机械通气和呼吸监护等情况，气道阻力的测定可以直接反映气道的阻塞情况，通常支气管哮喘、肺气肿等呼吸系统方面的障碍疾病均可引起气道阻力的增加。动态肺顺应性是指单位压力改变时所引起的肺容积的改变，它代表了胸腔压力改变对肺容积的影响，其监测结果在临床中可初步用于评价患者的肺功能。以上两个指标相互结合可以很好的反映气道的通气功能，本章研究内容正是基于气道阻力和动态肺顺应性的测定来评判药效作用。
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结论

1、本研究首先对硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液质量标准进行了复核，对选用的色谱条件进行了全面验证，并在实验室条件下开始进行三批小试制剂的稳定性考察，在此基础上继续开展左旋硫酸沙丁胺醇雾化溶液的质量研究，以合格原料药制备了三批小试制剂并进行稳定性考察。
2、粒度分布测试数据表明，自制左旋和消旋雾化溶液的 FPF%分别高达 72.81%和71.97%，MMAD 分别为 3.278 和 3.321，作为吸入制剂关键的评价标准与市售制剂具有一定的可比性，同时在模拟呼吸状态下的药物递送剂量达到了 2.704 ug/s 和2.727 ug/s，药物递送能力的差异与市售制剂均无显著性差异，一定程度上肯定了配方的合理性。
3、药效学实验证明，左旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入给药可以发挥显著的支气管扩张作用，使豚鼠的气道阻力上升率从 425.37%降低到 25.53%，动态肺顺应性的下降也得到了有效控制，而且这种药效的发挥与加倍剂量给药的消旋相比具有很好的一致性，更加支持了消旋体中是左旋体发挥疗效的结论，同时左旋体、消旋体药效在性别方面的差异得到了初步证实，而差异原因则有待于继续研究。本文为左旋硫酸沙丁胺醇雾化吸入溶液的临床前研究和上市打下了基础，为该剂型突破国外技术壁垒应用于中国市场提供了一定的指导，同时也为左旋硫酸沙丁胺醇其他剂型开发比如缓释片、干粉吸入剂研究中的质量控制和体外分析提供了借鉴和参考。
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本文编号：11595