全基因组siRNA文库在骨肉瘤细胞耐药中的作用及其生物学机制研究

发布时间：2024-04-27 21:57

　　骨肉瘤是原发性骨癌最常见的组织学形式,标准疗法是在患者身上使用药物治疗,然后采取截肢手术。在骨肉瘤治疗过程中有不少患者会逐渐对化疗产生耐药甚至会出现多药耐药的现象从而导致治疗的失败,因此,对骨肉瘤耐药机制的研究有助于通过避开和逆转耐药治疗靶点的方法来提高治疗效果和预后。本研究通过构建siRNA和抗癌药物的有效共递体系,找到影响药物发挥作用的关键基因,从而利用其可以诱导骨肉瘤细胞的死亡,同时抑制药物抗性的发生。在研究中我们采用了能够覆盖人的3万个基因的siRNA文库进行转染,再加上药物刺激,获得了具有耐化疗药物Nutlin3a的骨肉瘤细胞。然后由高通量测序找出了富集siRNA片段,分别或者组合转染使细胞获得耐药能力,再检测并对比了不同siRNA片段转染的细胞内重要基因的表达变化,最终找到了骨肉瘤细胞耐nutlin 3a的关键基因和潜在靶点。研究主要分为以下几个部分:(1)应用全基因组siRNA文库质粒刺激骨肉瘤细胞SJSA1,获得了具有耐药特性的n19-SJSA1-Nutlin3a细胞株。Nutlin3a对SJSA1亲代细胞的致死剂量是4μM,而我们构建的稳定耐药细胞株能承受40μM的N...

【文章页数】：165 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图1.1NEBGibsonDNAAssembly原理示意图

1绪论到骨架质粒上，从而构建了覆盖了人的全基因组siRNA文库逆转录病毒载体质粒。通过质粒的构建，克隆生长计数，菌落PCR及阳性质粒的测序，验证得到文库一次GibsonAssembly可以形成1.8×107个克隆数，并且发现插入片段具有明显的随机性和异质性。

图1.3Molab单次合成的siRNA文库的克隆数Figure1.3BacterialcolonscountingofthesiRNAlibraryfromMolab

图1.2MolabsiRNA文库质粒的基础图Figure1.2TheplasmidofsiRNAlibraryfromMolab文库质粒的覆盖面siRNA文库能够覆盖人的3万个基因，通过它可以筛查哪些基因在肿瘤的及发展中具有决定性的作用，从而诱导肿瘤....

图1.4MolabsiRNA文库质粒的菌落PCR及测序Figure1.4BacterialPCRandsequencingdataofsiRNAlibraryplasmidfromMolab

1绪论样性的菌落除了计数外，还要进行PCR鉴定，如下图构建的siRNA文库质粒的阳性率可以达到90%性结果进行检验测序，发现每一条siRNA的序样性，符合我们预期拟构建能够覆盖人的3万个

图1.5实验技术路线图

图1.5实验技术路线图Figure1.5Thetechnologyroutemapofexperiment1.4课题的特色及创新点①将随机且特异性覆盖人基因组的siRNA文库用逆转录病毒感染的方式导入骨肉瘤SJSA1细胞株中，在短时间内通过Nutlin....

本文编号：3965768