1α/BNIP3信号通路调节的低氧诱导自噬在唾液腺腺样囊性癌中的作用

发布时间：2016-10-29 11:51

  本文关键词：涎腺腺样囊性癌中BNIP3的表达与低氧自噬的关系及其临床病理特征，由笔耕文化传播整理发布。

《山东大学》 2015年

HIF-1α/BNIP3信号通路调节的低氧诱导自噬在唾液腺腺样囊性癌中的作用

陈占伟  

【摘要】：唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma, SACC)是头颈部唾液腺最常见的恶性肿瘤之一,具有嗜神经生长、远期复发率高及易发生全身远处转移等独特的生物学行为。因此,腺样囊性癌曾被描述为头颈部最具破坏性和不可预见性的肿瘤之一。目前,对于腺样囊性癌尚无行之有效的治疗方案,主要的治疗手段是手术联合放化疗的综合治疗为主,近年来有术后行I125放射性粒子植入作为辅助放疗的报道。虽然5年生存率较高,但其10年甚至更长时间生存率偏低,效果并不满意。因此,进一步了解腺样囊性癌的生物学行为和分子遗传学特征可能找提供新的见解和治疗策略。近年来随着对腺样囊性癌发生发展的分子机制研究的逐步深入,人们发现腺样囊性癌的治疗要想取得突破性进展,需要寻找更具针对性的新目的基因,通过基因转染抑制肿瘤细胞增殖、诱发肿瘤细胞凋亡,是肿瘤基因治疗策略之所在。低氧是实体肿瘤微环境中常见的现象。肿瘤在高速增殖的过程中,血管生成速度显著低于细胞增殖速度,氧供应的速度滞后于细胞对氧的需求,现已有大量研究表明低氧状态与肿瘤的侵袭性、血管再生、提高复发率及放化疗耐受性之间存在复杂的联系。作为氧平衡的重要调节因子,HIF-1是在低氧条件下重要的转录因子。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两种亚基组成的异源二聚体,HIF-1β是HIF-1的结构性亚基,在细胞内的表达相对稳定；HIF-1α是HIF-1的功能亚基,常氧条件下不断合成,同时不断经泛素-蛋白酶小体途径水解。低氧条件下,HIF-1a降解受阻,在细胞浆内积聚增多,向细胞核内转移,与HIF-1β结合调节靶基因的转录。HIF-1α已经在大多数常见的人类癌症中观察到,如头颈部的恶性肿瘤、卵巢癌和食道癌中,并与不良预后及治疗抵抗相关。Costa等发现HIF-la广泛的在唾液腺腺样囊性癌中表达,而在肿瘤附近正常唾液腺腺体组织鲜有表达。BNIP3,即Bcl2/腺病毒ElB 19 kDa相关蛋白3(BCL2/adenovirus ElB 19kDa interacting protein 3),属于促凋亡蛋白,其表达受HIF-1 α依赖的缺氧的调节及其他很多因素的影响。BNIP3蛋白主要定位于线粒体外膜,当其被激活后,完全整合入线粒体外膜,通过开放线粒体通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)损伤线粒体功能引起染色质凝聚、DNA分解,最终导致细胞凋亡。近年来,BNIP3的异常表达和很多肿瘤的进展、化疗耐药及自噬密切相关。BNIP3的表达受到转录因子HIF-la的调控,在低氧诱导细胞自噬凋亡过程中起重要的作用。然而,唾液腺腺样囊性癌中BNIP3的表达、其调节的低氧诱导自噬通路及临床病理学行为国内外尚未有文献报道。自噬指的是从粗面内质网上的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹的部分胞质和细胞内需要降解的细胞器和蛋白质等形成自噬体,与溶酶体融合后形成自噬溶酶体,进一步降解所包裹的多余蛋白质和亚细胞成分,来实现细胞本身的代谢需要和细胞器的更新,来维持自身的稳定。其整个过程主要分3个阶段：自噬小体的初步形成；自噬体膜的延伸；自噬体与溶酶体融合并降解。氯喹可以通过升高溶酶体内的PH值,进而阻止自噬体与溶酶体结合而抑制自噬。我们的研究团队在之前调查过79名患有头颈部腺样囊性癌的患者,观察自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链-3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3) 和Beclin1的表达,结果显示二者在腺样囊性癌形成的过程中起重要的作用。近期的研究已经发现低氧状态与诱导自噬之间存在某些联系,然而低氧诱导腺样囊性癌细胞自噬的分子机制尚未完全明确。目的：1、应用二氯化钴在体外构建细胞低氧模型,采用经其处理的腺样囊性癌细胞株ACC-M细胞,模拟其在体内的缺氧环境,观察缺氧条件下低氧相关的HIF-1 α/BNIP3通路相关基因、自噬相关基因Beclin1在腺样囊性癌细胞中的表达情况,探讨低氧对唾液腺腺样囊性癌ACC-M细胞增殖和自噬的影响。2、采用二氯化钻模拟低氧条件,研究低氧诱导的自噬对唾液腺腺样囊性癌ACC-M侵袭性的影响,研究氯喹通过抑制低氧诱导的自噬过程而对ACC-M细胞侵袭性的影响。方法：1、应用二氯化钴作为化学性低氧诱导剂,体外构建唾液腺腺样囊性癌ACC-M细胞低氧模型。2、MTT法对ACC-M细胞进行细胞活力测验,以检测二氯化钴对细胞增殖的抑制作用；透射电子显微镜观察自噬体形成；双免疫荧光标记、RT-PCR及Western blot检测低氧相关HIF-1α/BNIP3通路相关基因、自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链-3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)及Beclin1的表达,数据以平均数±标准误表示,采用SPSS15.0软件包进行two-tailedt检验,P0.05为差异具有显著性。3、观察比较经二氯化钴处理的ACC-M细胞和常氧状态下培养的细胞的侵袭能力；然后用氯喹(10μM and 20μM)处理实验组ACC-M细胞,通过细胞侵袭实验来对比实验组与对照组中癌细胞的侵袭能力。数据以平均数±标准误表示,采用SPSS15.0软件包进行two-tailed t检验,P0.05为差异具有显著性。结果：1、二氯化钴可以降低ACC-M细胞的活性,同时可以诱导自噬体的形成；透射电子显微镜下实验组细胞内可见到自噬体样的双层膜结构；RT-PCR及Western blot检测显示二氯化钴可明显使HIF-1α/BNIP3信号通路的相关基因和自噬的表达显著提高。2、与对照组相比,经过二氯化钻处理的ACC-M细胞在细胞侵袭实验中侵袭细胞的数量明显高于对照组(p0.001)；而后在经氯喹处理细胞侵袭细胞的数量明显减少,且剂量越高抑制作用越明显(p0.01)。结论：1、二氯化钴可以模拟低氧环境,从而诱导ACC-M细胞自噬现象的产生,同时HIF-1α/BNIP3信号通路在这个过程中扮演重要的角色。2、二氯化钴可以通过诱导ACC-M的自噬过程来增加肿瘤细胞的侵袭性；氯喹可以通过抑制低氧诱导的自噬过程来抑制腺样囊性癌肿瘤细胞的侵袭。

【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.8
【目录】：

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