人源叉头盒蛋白FOXA1的O-GalNAc及O-GlcNAc糖基化修饰位点鉴定
发布时间：2023-04-18 19:10
糖基化修饰是蛋白质翻译后修饰中主要的修饰方式之一。研究表明,细胞50%以上的蛋白质存在糖基化修饰。蛋白质糖基化在蛋白质的折叠、蛋白质胞内转运、受体活化、分子识别、信号传导、细胞内吞作用、分子稳态、细胞排斥、细胞黏附等众多生物过程中起着重要的调节作用。蛋白质糖基化分为N-糖基化、O-糖基化和GPI锚定糖基化。其中O-糖基化发生在蛋白质丝氨酸或苏氨酸残基的羟基氧原子上。O-连接氮乙酰半乳糖胺修饰(O-GalNAc)和O-连接氮乙酰葡糖胺修饰(O-GlcNAc)是两种重要的O-糖基化。O-GalNAc修饰糖基化反应由多肽GalNAc转移酶(ppGalNAc-Ts)催化起始,在其他特异性糖基转移酶催化下继续延伸,生成含有分枝O-连接复杂聚糖结构。O-GlcNAc糖基化则是在O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)催化下,利用UDP-GlcNAc为底物糖供体,将GlcNAc共价连接到蛋白质的丝/苏氨酸残基上的一种动态可逆单糖修饰。这两种O-糖基化修饰底物分布广泛,功能各异,参与调节了几乎所有重要生理过程和重大疾病的发生发展。本课题组前期研究表明,重要的人源转录因子叉头盒蛋白A1(FOXA1)可能发生...
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 绪论
1.1 蛋白质的糖基化修饰
1.1.1 O-GalNAc修饰
1.1.2 O-GlcNAc修饰
1.1.3 糖基化异常与疾病发生发展
1.2 转录因子FOXA1
1.2.1 FOXA1 概述
1.2.2 FOXA1 蛋白结构
1.2.3 FOXA1 生理功能
1.2.4 FOXA1 的糖基化修饰
1.3 本研究的目的和意义
2 体外反应体系鉴定人源FOXA1 蛋白的O-GalNAc修饰位点
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株、载体
2.2.2 实验仪器
2.2.3 实验试剂
2.2.4 实验溶液
2.3 实验方法
2.3.1 原核表达载体pET28a(+)-FOXA1 质粒的提取
2.3.2 人源FOXA1 蛋白的原核重组表达
2.3.3 SDS-PAGE电泳
2.3.4 考马斯亮蓝染色分析
2.3.5 Western Blot分析
2.3.6 人源FOXA1 蛋白的纯化
2.3.7 293 T细胞培养
2.3.8 糖基转移酶ppGalNAc-T2 的真核重组表达与纯化
2.3.9 糖基转移酶ppGalNAc-T2 的酶活鉴定
2.3.10 ppGalNAc-T2 糖基转移酶催化FOXA1 蛋白的酶活反应
2.3.11 蛋白质谱分析
2.4 实验结果
2.4.1 人源FOXA1 蛋白的原核重组表达与纯化
2.4.2 糖基转移酶ppGalNAc-T2 的真核重组表达与纯化
2.4.3 糖基转移酶ppGalNAc-T2 的酶活鉴定
2.4.4 ppGalNAc-T2 体外催化FOXA1 蛋白发生O-GalNAc修饰
2.4.5 蛋白质谱鉴定FOXA1 蛋白的O-GalNAc修饰位点
2.5 讨论
2.6 小结
3 体外反应体系鉴定人源FOXA1 蛋白的O-GlcNAc修饰位点
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 细胞、菌株和载体
3.2.2 实验仪器
3.2.3 实验试剂
3.2.4 实验溶液
3.3 实验方法
3.3.1 设计引物
3.3.2 FOXA1 基因扩增
3.3.3 PCR产物回收
3.3.4 FOXA1 基因、pMD19-T-Simple载体连接
3.3.5 连接产物的转化
3.3.6 限制性内切酶双酶切鉴定质粒及测序
3.3.7 表达载体pCMVPuro-HA与 pMD19-T-Simple-FOXA1 的双酶切
3.3.8 pCMVPuro-HA载体片段与FOXA1 目的基因片段的连接
3.3.9 pCMVPuro-FOXA1-HA转染293T细胞
3.3.10 真核细胞中FOXA1 重组蛋白的纯化
3.3.11 糖基转移酶OGT感受态细胞制备
3.3.12 FOXA1 蛋白与OGT糖基转移酶共表达BL21(DE3)菌株建立
3.3.13 O-GlcNAc修饰的重组FOXA1 蛋白的原核表达、纯化
3.3.14 蛋白质谱分析
3.4 实验结果
3.4.1 真核表达体系中重组FOXA1 蛋白的O-GlcNAc糖基化验证
3.4.2 O-GlcNAc糖基化原核反应体系的构建
3.4.3 O-GlcNAc修饰的重组FOXA1 蛋白的纯化
3.4.4 FOXA1的O-GlcNAc修饰位点的在线预测
3.4.5 蛋白质谱鉴定FOXA1 蛋白的O-GlcNAc修饰位点
3.5 讨论
3.6 小结
结论
参考文献
附录A pCMVPuro-FOXA1-HA质粒图谱
附录B FOXA1 蛋白的O-GlcNAc糖基化位点预测
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
本文编号：3792853
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 绪论
1.1 蛋白质的糖基化修饰
1.1.1 O-GalNAc修饰
1.1.2 O-GlcNAc修饰
1.1.3 糖基化异常与疾病发生发展
1.2 转录因子FOXA1
1.2.1 FOXA1 概述
1.2.2 FOXA1 蛋白结构
1.2.3 FOXA1 生理功能
1.2.4 FOXA1 的糖基化修饰
1.3 本研究的目的和意义
2 体外反应体系鉴定人源FOXA1 蛋白的O-GalNAc修饰位点
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 菌株、载体
2.2.2 实验仪器
2.2.3 实验试剂
2.2.4 实验溶液
2.3 实验方法
2.3.1 原核表达载体pET28a(+)-FOXA1 质粒的提取
2.3.2 人源FOXA1 蛋白的原核重组表达
2.3.3 SDS-PAGE电泳
2.3.4 考马斯亮蓝染色分析
2.3.5 Western Blot分析
2.3.6 人源FOXA1 蛋白的纯化
2.3.7 293 T细胞培养
2.3.8 糖基转移酶ppGalNAc-T2 的真核重组表达与纯化
2.3.9 糖基转移酶ppGalNAc-T2 的酶活鉴定
2.3.10 ppGalNAc-T2 糖基转移酶催化FOXA1 蛋白的酶活反应
2.3.11 蛋白质谱分析
2.4 实验结果
2.4.1 人源FOXA1 蛋白的原核重组表达与纯化
2.4.2 糖基转移酶ppGalNAc-T2 的真核重组表达与纯化
2.4.3 糖基转移酶ppGalNAc-T2 的酶活鉴定
2.4.4 ppGalNAc-T2 体外催化FOXA1 蛋白发生O-GalNAc修饰
2.4.5 蛋白质谱鉴定FOXA1 蛋白的O-GalNAc修饰位点
2.5 讨论
2.6 小结
3 体外反应体系鉴定人源FOXA1 蛋白的O-GlcNAc修饰位点
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 细胞、菌株和载体
3.2.2 实验仪器
3.2.3 实验试剂
3.2.4 实验溶液
3.3 实验方法
3.3.1 设计引物
3.3.2 FOXA1 基因扩增
3.3.3 PCR产物回收
3.3.4 FOXA1 基因、pMD19-T-Simple载体连接
3.3.5 连接产物的转化
3.3.6 限制性内切酶双酶切鉴定质粒及测序
3.3.7 表达载体pCMVPuro-HA与 pMD19-T-Simple-FOXA1 的双酶切
3.3.8 pCMVPuro-HA载体片段与FOXA1 目的基因片段的连接
3.3.9 pCMVPuro-FOXA1-HA转染293T细胞
3.3.10 真核细胞中FOXA1 重组蛋白的纯化
3.3.11 糖基转移酶OGT感受态细胞制备
3.3.12 FOXA1 蛋白与OGT糖基转移酶共表达BL21(DE3)菌株建立
3.3.13 O-GlcNAc修饰的重组FOXA1 蛋白的原核表达、纯化
3.3.14 蛋白质谱分析
3.4 实验结果
3.4.1 真核表达体系中重组FOXA1 蛋白的O-GlcNAc糖基化验证
3.4.2 O-GlcNAc糖基化原核反应体系的构建
3.4.3 O-GlcNAc修饰的重组FOXA1 蛋白的纯化
3.4.4 FOXA1的O-GlcNAc修饰位点的在线预测
3.4.5 蛋白质谱鉴定FOXA1 蛋白的O-GlcNAc修饰位点
3.5 讨论
3.6 小结
结论
参考文献
附录A pCMVPuro-FOXA1-HA质粒图谱
附录B FOXA1 蛋白的O-GlcNAc糖基化位点预测
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
本文编号：3792853
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