红斑丹毒丝菌GAPDH等分子致病作用研究及DNA聚合酶Ⅳ诊断标识验证

发布时间：2023-05-28 12:32

　　红斑丹毒丝菌是造成动物丹毒病和人类类丹毒病的病原体。所有动物丹毒病中猪丹毒的经济意义最大。目前研究认为红斑丹毒丝菌对血管内皮细胞的粘附是感染发病起始环节的关键,但是红斑丹毒丝菌的毒力因子和致病机制依然不很清楚。本研究比较系统地研究了红斑丹毒丝菌致病表型。研究了GAPDH等5个红斑丹毒丝菌表面蛋白的致病作用,评估了这5个蛋白作为保护性抗原的潜质。最后,我们建立和改进了区分红斑丹毒丝菌疫苗菌株和野生型菌株的方法。本研究结果表明:红斑丹毒丝菌可以粘附血管内皮细胞,且强毒菌株表现出更高的粘附活性。红斑丹毒丝菌不能直接损伤血管内皮细胞。红斑丹毒丝菌能够利用宿主的血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白,强毒菌株表现出更高的招募活性。红斑丹毒丝菌具有抵抗全血杀伤能力且强毒菌株表现出更强的抵抗能力。红斑丹毒丝菌强毒菌株的占优势的免疫反应是Th1型反应。本研究克隆、表达、纯化了5个红斑丹毒丝菌表面蛋白:Spa A、Cbp B、GAPDH、HP0728、HP1472。研究结果显示它们都定位于红斑丹毒丝菌菌体表面。我们的研究结果显示表面蛋白Spa A、Cbp B、GAPDH、HP1472可以在红斑丹毒丝菌粘附血...

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【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
缩略词
1 文献综述
    1.1 红斑丹毒丝菌研究进展
        1.1.1 微生物学特性
        1.1.2 猪丹毒及其他动物的丹毒病
        1.1.3 人类红斑丹毒丝菌感染
    1.2 红斑丹毒丝菌毒力因子和致病机制
        1.2.1 已知的毒力因子和致病机制
        1.2.2 相关领域研究进展
    1.3 丹毒疫苗研究进展
        1.3.1 传统疫苗
        1.3.2 弱毒疫苗和野生型菌株的鉴别诊断
        1.3.3 新型疫苗研究进展
    1.4 本研究的内容与目标
2 红斑丹毒丝菌致病性表型研究
    2.1 材料与方法
        2.1.1 菌株、细胞系及培养条件
        2.1.2 小鼠致病性实验
        2.1.3 细胞粘附实验
        2.1.4 细胞毒性试验
        2.1.5 血浆纤维蛋白溶解酶原招募活性检测
        2.1.6 粘附促进实验
        2.1.7 招募plasminogen和fibronectin能力比较
        2.1.8 全血杀菌实验
        2.1.9 血清制备和IgG1/IG2a类型检测
        2.1.10 统计分析
    2.2 结果
        2.2.1 小鼠致病性实验
        2.2.2 猪髋动脉血管内皮细胞粘附实验
        2.2.3 细胞毒性实验
        2.2.4 招募血浆纤维蛋白溶解酶原的活性检测
        2.2.5 血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白的粘附促进实验
        2.2.6 招募血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白能力的比较
        2.2.7 全血杀菌实验
        2.2.8 IgG1/IgG2a类型测定
    2.3 讨论
3 GAPDH等红斑丹毒丝菌表面蛋白的致病作用研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 菌株、细胞系和培养条件
        3.1.2 待研究的红斑丹毒丝菌表面蛋白的筛选
        3.1.3 克隆、表达和纯化重组的红斑丹毒丝菌表面蛋白
        3.1.4 重组GAPDH活性测定
        3.1.5 制备多克隆血清
        3.1.6 红斑丹毒丝菌表面蛋白分布测定
        3.1.7 猪髋动脉血管内皮细胞粘附实验
        3.1.8 竞争粘附抑制实验
        3.1.9 血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白绑定活性检测
    3.2 结果
        3.2.1 红斑丹毒丝菌致病性相关表面蛋白的筛选
        3.2.2 蛋白的克隆、表达和纯化
        3.2.3 rGAPDH的酶活性
        3.2.4 表面定位检测
        3.2.5 重组表面蛋白对猪血管内皮细胞的粘附
        3.2.6 竞争粘附抑制实验
        3.2.7 血浆纤维蛋白溶解酶原和纤维连接蛋白结合活性
    3.3 讨论
        3.3.1 SpaA的致病作用
        3.3.2 CbpB的致病作用
        3.3.3 GAPDH的致病作用
        3.3.4 HP0728的致病作用
        3.3.5 HP1472的致病作用
        3.3.6 未来应该做的工作
        3.3.7 小结
4 GAPDH等红斑丹毒丝菌表面蛋白的保护力研究
    4.1 重组红斑丹毒丝菌表面蛋白的保护力
        4.1.1 材料与方法
        4.1.2 结果
        4.1.3 讨论
    4.2 对GAPDH作为广谱疫苗的评估
        4.2.1 材料与方法
        4.2.2 结果
        4.2.3 讨论
5 红斑丹毒丝菌疫苗弱和野毒菌株鉴别诊断方法的建立
    5.1 基于SNP区分猪丹毒疫苗株和野毒株的PCR方法的修正
        5.1.1 材料与方法
        5.1.2 结果
        5.1.3 讨论
    5.2 区分猪丹毒疫苗菌株和野生型菌株的双重PCR方法的建立
        5.2.1 材料与方法
        5.2.2 结果
        5.2.3 讨论
6 总结
参考文献
附录
研究生期间的论文与专利
致谢



本文编号：3824597