CRISPR/Cas9技术介导绒山羊VEGF基因定点整合的研究

发布时间：2023-04-02 21:30

　　内蒙古阿尔巴斯白绒山羊是我国一种独特的生物资源,经过长期的自然选择和人工选育成为目前世界上产绒量最高、绒纤维品质最好的品种之一。提高绒山羊产绒量,培育高产、优质的绒山羊新品种是绒山羊育种工作目标。本实验室已获得转VEGF基因的绒山羊且产绒量明显提高,显示出良好的育种前景。近些年,通过基因组编辑技术可以快速改变特定性状基因组成,获得所需优良品种。本实验利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,选用高表达位点CCR5,构建CCR5基因gRNA载体和VEGF基因定点敲入载体,利用电转染法将载体转入绒山羊胎儿成纤维细胞中,筛选出VEGF基因在CCR5位点定点敲入的阳性细胞。将该细胞作为核供体细胞,应用体细胞核移植技术生产出VEGF基因定点整合绒山羊,以便为培育产绒量高、绒纤维品质好的绒山羊新品种提供实验依据。1.载体构建本实验成功构建了4对基于CCR5基因二号外显子的gRNA表达载体,通过SURVEYOR酶切突变检测到CCR5-gRNA4发生突变,其他三对没有检测到突变,确定gRNA表达载体为CCR5-gRNA4。同时成功构建了在CCR5位点定点整合VEGF基因敲入的载体P1-KV-polyA...

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述 CRISPR/Cas 系统概述
    一、CRISPR/CAS系统的历史
    二、CRISPR/CAS系统的结构
    三、CRISPR/CAS系统的类型
    四、CRISPR/CAS系统的免疫作用机制
    五、CRISPR/CAS9系统的特点
    六、CRISPR/CAS9技术的应用
    七、CRISPR/CAS9技术目前存在的问题
    八、CRISPR/CAS9技术的展望
第二章 CRISPR/CAS9技术介导绒山羊VEGF基因定点整合的研究
    1 引言
        1.1 CRISPR/CAS9介导VEGF基因在CCR5位点定点敲入载体的构建
        1.2 CRISPR/CAS9介导VEGF基因打靶细胞系的筛选及鉴定
        1.3 定点敲入VEGF基因的绒山羊制备与检测
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 主要仪器设备
            2.1.2 主要试剂及耗材
            2.1.3 实验材料
        2.2 实验方法
            2.2.1 绒山羊胎儿成纤维细胞电转染法转染条件的确定
            2.2.2 VEGF外源基因整合载体P1-KV-polyA-P2的构建
            2.2.3 绒山羊胎儿成纤维细胞分离及培养
            2.2.4 绒山羊胎儿成纤维细胞的解冻及复苏
            2.2.5 绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定
            2.2.6 VEGF打靶载体P1-KV-polyA-P2转染绒山羊胎儿成纤维细胞
            2.2.7 VEGF基因定点敲入阳性细胞的筛选
            2.2.8 VEGF基因打靶阳性细胞的鉴定
            2.2.9 体细胞核移植技术制备重构胚胎
            2.2.10 原核注射技术制备克隆胚胎
            2.2.11 移植及产羔
            2.2.12 定点整合VEGF基因绒山羊的鉴定
    3 实验结果
        3.1 绒山羊胎儿成纤维细胞电转染法转染条件的确定
        3.2 gRNA表达载体设计和构建
            3.2.1 gRNA的设计
            3.2.2 gRNA表达载体的构建
            3.2.3 CRISPR/Cas9表达载体的质量检测
            3.2.4 Surveyor突变检测试剂盒检测结果
        3.3 VEGF外源基因敲入载体P1-KV-polyA-P2
            3.3.1 上游同源臂(P1)下游同源臂(P2)及polyA序列的克隆
            3.3.2 打靶载体P1-KV-polyA-P2的构建
            3.3.3 打靶载体P1-KV-polyA-P2鉴定
        3.4 阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞的分离与培养
        3.5 绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定
        3.6 VEGF打靶载体P1-KV-polyA-P2转染绒山羊胎儿成纤维细胞
        3.7 VEGF基因打靶阳性细胞的鉴定
        3.8 卵母细胞体外成熟及发育
        3.9 重构胚胎移植及产羔
        3.10 定点整合VEGF基因绒山羊的鉴定
            3.10.1 新生羊PCR扩增检测
            3.10.2 新生绒山羊皮肤组织中VEGF基因的mRNA表达情况
            3.10.3 新生绒山羊皮肤组织中VEGF基因蛋白水平表达情况
    4 讨论
        4.1 CRISPR/CAS9介导VEGF基因在CCR5位点定点敲入载体的构建
        4.2 CRISPR/CAS9介导VEGF基因打靶细胞系的筛选及鉴定
        4.3 定点敲入VEGF基因的绒山羊制备与检测
参考文献
结论
致谢
攻读学位期间已发表学术论文



本文编号：3779995