猪瘟病毒蛋白在宿主细胞中的表达及其对病毒感染的调控作用
发布时间：2023-04-02 18:15
本文以CSFV蛋白在宿主细胞中表达为研究基础,分别研究：各蛋白在感染细胞中表达情况；在细胞中各蛋白真核表达情况；在细胞中真核表达的各蛋白对宿主细胞的影响；以及在细胞中真核表达的各蛋白对病毒感染的影响。 为研究猪瘟病毒蛋白在感染细胞中表达情况,将原核表达的各个CSFV蛋白纯化后分别免疫昆明小鼠制备多克隆抗体血清。结果获得除P7蛋白外11个重组CSFV蛋白并制备获得高滴度抗体的免疫血清。Western-Blotting能检测到病毒各蛋白片段与预期大小的一致,其中E0、E1、E2和NS5A还以蛋白聚合体形式存在。间接免疫荧光分析(Indirect Immuno-fluorescence Assay IFA)检测显示Npro主要定位于细胞核；C、E0和NS2在细胞核亦有分布,但主要是位于细胞质中；其他蛋白则位于细胞质中；E0蛋白还在细胞膜表面有分布。结果分析表明,分布于细胞核上的CSFV蛋白可能对细胞有调控作用,而分布于细胞质内的蛋白则主要参与病毒复制、组装和增殖。 将CSFV C株各蛋白基因以pEGFP-N1为载体构建成真核表达质粒,转染ST细胞来研究各蛋白在细胞中真核表达情况。PCR检测结...
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 CSFV分子生物学特性
2 CSFV感染宿主细胞的途径和机制
3 CSFV感染免疫抑制机理
4 CSFV感染致组织病变及机理
5 CSFV在感染细胞中复制增殖机制
6 结构蛋白在CSFV感染中的作用
7 非结构蛋白在CSFV感染细胞中的作用
8 展望及本研究目的
第二章 CSFV蛋白在感染细胞中表达情况的研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株、细胞和实验动物
1.1.2 引物设计与合成
1.1.3 主要试剂和耗材
1.2 方法
1.2.1 CSFV蛋白原核表达载体的构建
1.2.2 CSFV蛋白原核表达与鉴定
1.2.3 蛋白纯化
1.2.4 多克隆抗体制备
1.2.5 Western blotting检测CSFV感染细胞中病毒蛋白
1.2.6 IFA鉴定CSFV感染细胞中病毒蛋白
2 结果
2.1 CSFV蛋白原核表达载体的构建
2.2 CSFV蛋白原核表达、鉴定及纯化
2.3 ELISA检测CSFV蛋白免疫小鼠血清抗体
2.4 Western blotting检测CSFV感染细胞中病毒蛋白
2.5 IFA鉴定CSFV感染细胞中病毒蛋白
3 分析与讨论
4 小结
第三章 CSFV蛋白真核表达研究及稳定表达细胞系的建立
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、大肠杆菌感受态细胞、病毒和ST细胞
1.1.2 引物设计与合成
1.1.3 主要试剂和耗材
1.2 方法
1.2.1 CSFV蛋白真核表达载体的构建
1.2.2 细胞转染及筛选
1.2.3转染细胞检测
1.2.4 细胞克隆及稳定表达细胞系建立
1.2.5 细胞系稳定性及细胞增殖情况测定
1.2.6 细胞周期测定
2 结果
2.1 CSFV蛋白真核表达载体的构建
2.2 细胞转染及筛选
2.3 转染细胞中目的蛋白基因检测
2.4 转染细胞中荧光观察
2.4.1 荧光信号强弱
2.4.2 荧光信号分布
2.5 细胞克隆及稳定表达细胞系的鉴定
2.6 细胞系稳定性及增殖情况测定
2.7 细胞周期测定
3 分析与讨论
4 小结
第四章 各CSFV蛋白真核表达后对病毒感染影响的研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和病毒
1.1.2 引物设计与合成
1.1.3 主要试剂和耗材
1.2 方法
1.2.1 RNA提取及反转录合成cDNA
1.2.2 pMD-Actin质粒构建
1.2.3 检测CSFV实时荧光定量RT-PCR方法的建立
1.2.4 实时荧光定量RT-PCR检测CSFV蛋白细胞系中病毒滴度
2 结果
2.1 质粒的构建和提取
2.2 检测CSFV荧光实时定量RT-PCR方法建立
2.2.1 检测CSFV基因和β-Actin基因的竞争曲线
2.2.2 直线回归方程的建立
2.3 实时荧光定量RT-PCR检测CSFV蛋白细胞系中病毒滴度
3讨论分析
4 小结
第五章 EO分泌及其在CSFV释放中的作用研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和病毒
1.1.2 主要试剂和耗材
1.2 方法
1.2.1 转染细胞中荧光蛋白定位分析
1.2.2 荧光显微镜检测细胞培养基中融合蛋白
1.2.3 Western blotting检测细胞培养基中融合蛋白
1.2.4 CSFV感染蛋白细胞系中病毒滴度的检测
1.2.5 CSFV感染细胞培养基中病毒分布情况
2 结果
2.1 转染细胞荧光蛋白定位分析
2.2 荧光显微镜检测细胞培养基中融合蛋白
2.3 Western blotting检测细胞培养基中融合蛋白
2.4 CSFV感染蛋白细胞系中病毒滴度的检测
2.5 CSFV感染细胞培养基中病毒粒子分析
3 讨论分析
4 小结
全文总结及论文创新之处
参考文献
附录
缩略词中英文对照表
致谢
个人简历
本文编号：3779704
【文章页数】：115 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 CSFV分子生物学特性
2 CSFV感染宿主细胞的途径和机制
3 CSFV感染免疫抑制机理
4 CSFV感染致组织病变及机理
5 CSFV在感染细胞中复制增殖机制
6 结构蛋白在CSFV感染中的作用
7 非结构蛋白在CSFV感染细胞中的作用
8 展望及本研究目的
第二章 CSFV蛋白在感染细胞中表达情况的研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、菌株、细胞和实验动物
1.1.2 引物设计与合成
1.1.3 主要试剂和耗材
1.2 方法
1.2.1 CSFV蛋白原核表达载体的构建
1.2.2 CSFV蛋白原核表达与鉴定
1.2.3 蛋白纯化
1.2.4 多克隆抗体制备
1.2.5 Western blotting检测CSFV感染细胞中病毒蛋白
1.2.6 IFA鉴定CSFV感染细胞中病毒蛋白
2 结果
2.1 CSFV蛋白原核表达载体的构建
2.2 CSFV蛋白原核表达、鉴定及纯化
2.3 ELISA检测CSFV蛋白免疫小鼠血清抗体
2.4 Western blotting检测CSFV感染细胞中病毒蛋白
2.5 IFA鉴定CSFV感染细胞中病毒蛋白
3 分析与讨论
4 小结
第三章 CSFV蛋白真核表达研究及稳定表达细胞系的建立
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、大肠杆菌感受态细胞、病毒和ST细胞
1.1.2 引物设计与合成
1.1.3 主要试剂和耗材
1.2 方法
1.2.1 CSFV蛋白真核表达载体的构建
1.2.2 细胞转染及筛选
1.2.3转染细胞检测
1.2.4 细胞克隆及稳定表达细胞系建立
1.2.5 细胞系稳定性及细胞增殖情况测定
1.2.6 细胞周期测定
2 结果
2.1 CSFV蛋白真核表达载体的构建
2.2 细胞转染及筛选
2.3 转染细胞中目的蛋白基因检测
2.4 转染细胞中荧光观察
2.4.1 荧光信号强弱
2.4.2 荧光信号分布
2.5 细胞克隆及稳定表达细胞系的鉴定
2.6 细胞系稳定性及增殖情况测定
2.7 细胞周期测定
3 分析与讨论
4 小结
第四章 各CSFV蛋白真核表达后对病毒感染影响的研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和病毒
1.1.2 引物设计与合成
1.1.3 主要试剂和耗材
1.2 方法
1.2.1 RNA提取及反转录合成cDNA
1.2.2 pMD-Actin质粒构建
1.2.3 检测CSFV实时荧光定量RT-PCR方法的建立
1.2.4 实时荧光定量RT-PCR检测CSFV蛋白细胞系中病毒滴度
2 结果
2.1 质粒的构建和提取
2.2 检测CSFV荧光实时定量RT-PCR方法建立
2.2.1 检测CSFV基因和β-Actin基因的竞争曲线
2.2.2 直线回归方程的建立
2.3 实时荧光定量RT-PCR检测CSFV蛋白细胞系中病毒滴度
3讨论分析
4 小结
第五章 EO分泌及其在CSFV释放中的作用研究
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞和病毒
1.1.2 主要试剂和耗材
1.2 方法
1.2.1 转染细胞中荧光蛋白定位分析
1.2.2 荧光显微镜检测细胞培养基中融合蛋白
1.2.3 Western blotting检测细胞培养基中融合蛋白
1.2.4 CSFV感染蛋白细胞系中病毒滴度的检测
1.2.5 CSFV感染细胞培养基中病毒分布情况
2 结果
2.1 转染细胞荧光蛋白定位分析
2.2 荧光显微镜检测细胞培养基中融合蛋白
2.3 Western blotting检测细胞培养基中融合蛋白
2.4 CSFV感染蛋白细胞系中病毒滴度的检测
2.5 CSFV感染细胞培养基中病毒粒子分析
3 讨论分析
4 小结
全文总结及论文创新之处
参考文献
附录
缩略词中英文对照表
致谢
个人简历
本文编号：3779704
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